鄭志偉，勞海燕，余細(xì)勇，，陳紀(jì)言，林秋雄，麥麗萍，鐘詩龍，△

(1南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515;2廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，3廣東省心血管病研究所，廣東 廣州 510080)

MicroRNA(miRNA)是一類小分子非編碼單鏈RNA，通過與靶基因互補(bǔ)配對影響翻譯水平，在轉(zhuǎn)錄后水平對生物體基因的表達(dá)起精細(xì)的調(diào)節(jié)作用［1］。它在生物體的生長、發(fā)育及疾病的發(fā)生發(fā)展等過程中起著十分重要的作用。目前人們關(guān)注的主要是miRNA在組織細(xì)胞內(nèi)的功能，但是近來研究發(fā)現(xiàn)，血漿中也存在大量的循環(huán)miRNA，并且不同的生理疾病的狀態(tài)下血漿中的miRNA表達(dá)譜各不相同［2，3］。血漿循環(huán)miRNA在腫瘤、糖尿病等多種疾病中呈特異性表達(dá)，提示血漿miRNA可作為潛在的生物標(biāo)記物用于疾病的診斷和治療。從研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA在腫瘤、心衰、心肌梗死和糖尿病等疾病中的顯著意義以來，人們就一直致力于循環(huán)miRNA可否用于臨床疾病的無創(chuàng)診斷預(yù)警方面的應(yīng)用研究，隨著檢測技術(shù)方法的不斷進(jìn)步，循環(huán)miRNA在疾病診斷中的應(yīng)用研究成為研究的熱點(diǎn)。本研究旨在檢測冠心病患者和健康對照血漿中循環(huán)miR－126和miR－16的表達(dá)，進(jìn)一步通過抑制miR－126在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，觀察miR－126對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的影響。

材料和方法

1 材料

Trizol LS和Trizol試劑購自Invitrogen;氯仿、異戊醇購于廣州化學(xué)試劑廠;proteinase K、glycogen、Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix、TurboFectTMsiRNA transfection reagent購于 Fermentas;hsa－miR－126抑制劑由上海吉瑪制藥公司合成;莖環(huán)引物和上、下游引物由Invitrogen合成;dNTP(10 mmol/L)、RNase free 水、RNA inhibitor、M － MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于TaKaRa;DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;0.25%胰酶溶液購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

AG 22331 Hamburg PCR儀及DNA Engine Opticon 2熒光定量PCR系統(tǒng)分別為Eppendorf和MJ Research產(chǎn)品;NanoDrop 1000為 Thermo Scientific產(chǎn)品。

2 方法

2.1 血樣標(biāo)本的收集與處理 本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入選人群均簽署知情同意書，EDTA抗凝管收集診斷為冠心病(coronary artery disease，CAD)并且發(fā)生急性心肌梗死后48～72 h的患者血樣標(biāo)本4 mL，入選者排除患有其它嚴(yán)重疾病及肝腎功能不全的患者;同時(shí)收取健康體檢者(healthy control，HC)作為健康對照。新鮮標(biāo)本通過3000 r/min、4℃離心15 min，分離上層血漿和下層血細(xì)胞層，上層血漿繼續(xù)12000 r/min、4℃離心5 min，EP管分裝，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血漿總RNA的提取 104例標(biāo)本各取250 μL的血漿，加入10 μL的proteinase K進(jìn)行消化，然后依次加入750 μL Trizol LS和200 μL酚氯仿進(jìn)行提取。具體的提取方法按照Trizol LS試劑盒的說明進(jìn)行。提取總RNA用40 μL的無RNA酶水，瞬時(shí)離心。使用NanoDrop 1000檢測總RNA的濃度，采用A260/A280判斷RNA的質(zhì)量。

2.3 血漿miRNA的檢測

①cDNA逆轉(zhuǎn)錄 用M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系如下:4.875 μL水、2 μL 10×RT 緩 沖 液、0.375 μL dNTP Mix、RNA 酶 抑制劑 0.25 μL、逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物(1 μmol/L)0.5 μL、反轉(zhuǎn)錄酶 0.25 μL及總 RNA 樣品 2 μL，共計(jì) 10 μL，混勻后稍離心在 PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。RT參數(shù)設(shè)置為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 1 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)物置－4℃凍存?zhèn)溆?。反?yīng)設(shè)置無模板對照體系。hsa－miR－126莖環(huán)引物:5'－GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCATT－3'。hsa－miR－16莖環(huán)引物:5'－GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCCAATA －3'。

② 熒光定量檢測 取 cDNA 2 μL，依次加 Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各0.25 μL，水2.5 μL，共計(jì)10 μL，用DNA Engine Opticon 2熒光定量PCR進(jìn)行定量擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)設(shè)定為95℃ 5 min進(jìn)行預(yù)變性，然后95℃ 12 s，65℃ 50 s，共40個(gè)循環(huán)，最后做熔解曲線，標(biāo)本做復(fù)管PCR反應(yīng)，重復(fù)2次。同時(shí)做陰性對照和不加模板cDNA，而以水代替的反應(yīng)，用于檢驗(yàn)是否存在PCR污染和較高的引物二聚體污染。hsa－miR－126上游引物5'－GTCCGCTCGTACCGTGAGTAATA －3'，下游引物 5'－GTGCGTGTCGTGGAGTC－3';hsa－miR－16上游引物5'－GTCCGCTAGCAGCACGTAAATATT －3'，下游引物 5'－TGGTGTCGTGGAGTCG －3'。

2.4 內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

①EA.hy926細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F－12培養(yǎng)，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。

② 轉(zhuǎn)染miR－126 inhibitor 轉(zhuǎn)染前1 d，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞至密度為1×108/L，鋪板于6孔板中，每孔1 mL，補(bǔ)加DMEM/F12培養(yǎng)基至2 mL，37℃，5%CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，6孔板換培養(yǎng)基，采用陽離子脂質(zhì)體TurboFectTMsiRNA transfection reagent介導(dǎo)，加入miR－126抑制劑(終濃度為100 nmol)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對照(negative control，NC)，每孔平行4次。

③轉(zhuǎn)染后檢測miR－126和血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染30 h，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，用Trizol提取細(xì)胞RNA，NanoDrop 1000檢測總RNA的濃度和質(zhì)量，實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR－126及VEGF的表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，以兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析病例組與正常對照組均數(shù)間的差異。

結(jié) 果

1 患者的一般資料

收集的血樣標(biāo)本均為診斷冠心病心肌梗死型的患者 52例，其中男 43例，女 9例，平均年齡為(61.46±12.11)歲;同期收取體檢健康對照52例，其中男42例，女10例，平均年齡為(62.58±2.32)歲。所選患者的年齡(P＞0.05)和性別(P＞0.05)經(jīng)過t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)無顯著差異。入選者排除患有其它嚴(yán)重疾病及肝腎功能不全的患者，52例冠心病患者肝腎功能的生化指標(biāo)如下:谷丙轉(zhuǎn)氨酶:(34.52±21.54)U/L;谷草轉(zhuǎn)氨酶:(45.66±54.40)U/L;血肌酐:(88.88±20.60)μmoI/L;尿素氮:(4.81±1.47)mmol;總蛋白:(65.66±7.89)g/L;白蛋白:(35.30±3.29)g/L。

2 血漿miRNA表達(dá)

將收集的標(biāo)本分為2組:心肌梗死組和健康對照組。提取血漿總RNA，采用莖環(huán)熒光定量檢測方法檢測miR－126和miR－16，結(jié)果顯示血漿循環(huán)miR－126在兩組之間的表達(dá)差異顯著(P＜0.05)，血漿循環(huán)miR－126在冠心病患者的血漿中表達(dá)明顯下降;而血漿循環(huán)miR－16在血漿中表達(dá)豐度較高，在兩組間表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，見圖1、2。

3 轉(zhuǎn)染后檢測miR－126和VEGF的表達(dá)

EA.hy926轉(zhuǎn)染miR－126 inhibitor 30 h后，與陰性對照組相比，抑制劑組miR－126的表達(dá)明顯下調(diào)，miR－126在抑制劑組的表達(dá)為陰性對照組的0.0052倍(P＜0.05)，而陰性對照組跟不加任何干預(yù)的空白組miR－126的表達(dá)沒有明顯差異(P＞0.05);轉(zhuǎn)染后檢測VEGF的表達(dá)，抑制劑組VEGF的表達(dá)明顯增加，與陰性對照組相比，VEGF的表達(dá)上升了2.08倍(P＜0.05)，而陰性對照組跟不加任何干預(yù)的空白組VEGF的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，見表 1、圖3。

Figure 1.Plasma circulating miR －126 level in patients with CAD and heal-thy volunteers..n=52.*P＜0.05 vs healthy control.Expression of miR － 126 in EDTA－plasma obtained from patients with CAD and healthy volunteers was determined by real－time PCR.圖1 血漿循環(huán)miR－126在冠心病患者和健康人群中的表達(dá)

Figure 2.Plasma circulating miR－16 level in patients with CAD and healthy volunteers..n=52.Expression of miR－16 in EDTA－plasma obtained from patients with CAD and healthy volunteers was determined by real－time PCR.圖2 血漿循環(huán)miR－16在冠心病患者和健康人群中的表達(dá)

討 論

miRNA是一類長約22 nt的非編碼單鏈小RNA分子，可以通過與靶基因3'UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，促進(jìn)目標(biāo)mRNA的降解或者抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而在細(xì)胞、組織或個(gè)體水平上影響生物體的生長發(fā)育，并參多種疾病發(fā)生和發(fā)展過程［4］。大量研究表明miRNA在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，且與心血管疾病如高血壓、心律失常、心肌肥厚等密切相關(guān)［5］。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并被miRBase［6］數(shù)據(jù)庫收錄的人類miRNA分子有16772種(http://www.mirbase.org/index.shtml)。其中絕大部分的miRNA分子在不同病理和生理狀況下進(jìn)行表達(dá)，并且許多miRNA能夠在人體液中檢出。Chen等［7］應(yīng)用Solexa測序技術(shù)對正常的中國人血清miRNA進(jìn)行測序分析，在男性和女性血清中分別發(fā)現(xiàn)了100種和91種miRNA分子，并且通過實(shí)驗(yàn)證明了血漿中內(nèi)源性miRNA是比較穩(wěn)定的。Mitchell等［8］采用基于莖環(huán)的RTPCR方法證明了血漿中miRNA比較穩(wěn)定，并且血漿和血清中的樣本檢測有很好的相關(guān)性，都很適合作為血液基礎(chǔ)的標(biāo)志物。

表1 轉(zhuǎn)染miR－126抑制劑30 h后EA.hy926細(xì)胞中miR－126的表達(dá)Table 1.The miR －126 expression in EA.hy926 cells 30 h after transfeced with miR－126 inhibitor(.n=4)

表1 轉(zhuǎn)染miR－126抑制劑30 h后EA.hy926細(xì)胞中miR－126的表達(dá)Table 1.The miR －126 expression in EA.hy926 cells 30 h after transfeced with miR－126 inhibitor(.n=4)

*P ＜0.05 vs negative control.The miRNA expression is represented as cycle threshold(Ct)values from qRT － PCR analysis.The Ct values are inversely related to the expression level.Delta Ct(ΔCt)values are defined as the raw CtmiR－126－ CtU6for that sample.Relative quantification(RQ)reflects the ratio of expression in the transfection group relative to the negative control and is calculated as 2 －ΔΔCt，in which ΔΔCt is defined as the ΔCttransfection－ΔCtnegative control.

Group Mean Ct ΔCt ΔΔCt RQ miR －126 inhibitor20.69±0.52 5.73±0.60 7.70±0.60 0.0052±0.0022*0±0.3300 Negative control 13.60±0.35 －1.97±0.38 7.40±0.38 1.0300±0.2500 Blank 13.72±0.49 －1.89±0.48 0.07±0.48 0.990

Figure 3.The VEGF expression in EA.hy926 cells 30 h after transfected with miR－126 inhibitor..n=4.*P＜ 0.05 vs negative control.Relative quantification(RQ)reflects the ratio of expression in the transfection group relative to the negative control and is calculated as 2 －ΔΔCt，in which ΔΔCt is defined as the ΔCttransfection－ΔCtnegative control.圖3 轉(zhuǎn)染 miR－126抑制劑30 h后 EA.hy926細(xì)胞中VEGF的表達(dá)

本研究采用Trizol LS提取血漿總RNA，采用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄－熒光定量的方法檢測血漿循環(huán)miRNA的表達(dá)，在收集的52份冠心病心肌梗死型的血漿樣本和52份健康對照的血漿樣本檢測中，發(fā)現(xiàn)miR－126的表達(dá)在兩組之間存在顯著差異，miR－126在冠心病心肌梗死組的表達(dá)明顯下降，而miR－16的表達(dá)在兩組之間顯著差異，表達(dá)的豐度較高，在兩組人群中的表達(dá)相對較穩(wěn)定。miR－126在冠心病患者的表達(dá)下降有可能預(yù)示疾病的發(fā)生和發(fā)展。

進(jìn)一步我們通過生物學(xué)信息學(xué)軟件預(yù)測VEGF可能是miR－126的靶基因，miR－126有可能通過作用于VEGF的3'UTR端而起到抑制基因表達(dá)的作用。血管新生是心肌缺血的代償性反應(yīng)，促進(jìn)缺血心肌的血管新生已經(jīng)成為缺血性心血管疾病治療學(xué)的研究熱點(diǎn)，VEGF是重要的促血管生長因子。目前發(fā)現(xiàn)VEGF具有特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長因子，它能誘導(dǎo)血管新生、重構(gòu)，增加血管通透性，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞向動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)遷移［9］。急慢性心肌缺血、缺氧能夠迅速增加VEGF及其受體的表達(dá)，給予外源性VEGF或其基因可以促進(jìn)缺血心肌血管新生和側(cè)枝循環(huán)的形成［10］。近年來，科學(xué)家證實(shí)VEGF在動脈粥樣硬化斑塊的增殖和活化中起著重要作用。Inoue等［11］發(fā)現(xiàn)人正常冠狀動脈壁并不表達(dá)VEGF或非常少量的表達(dá)，而在動脈粥樣硬化斑塊中卻大量表達(dá)。尹瑞興等［12］發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性急性心肌梗死大鼠的血清VEGF水平持續(xù)顯著升高，于心肌梗死后1 h開始，6 h組顯著高于假手術(shù)對照組，24 h組達(dá)高峰，然后轉(zhuǎn)低，但梗死后14 d組仍顯著高于對照組。在本實(shí)驗(yàn)中，我們在血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR－126抑制劑，抑制miR－126的表達(dá)，VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)，跟陰性對照組相比差異顯著，說明miR－126有可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)。在動脈粥樣硬化斑塊的增殖過程中常伴隨滋養(yǎng)層血管的生長，VEGF的表達(dá)有可能升高，而伴隨著有可能是行負(fù)性調(diào)控的miR－126的表達(dá)降低，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄后對VEGF的調(diào)節(jié)失調(diào)，因此，血漿miR－126表達(dá)水平降低有可能成為冠心病血管病變發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要的生物預(yù)警，對冠心病或者是急性心肌梗死發(fā)作的早期診斷和預(yù)防有一定的指示作用，其具體作用仍需擴(kuò)大臨床樣本量，更進(jìn)一步研究血漿miR－126表達(dá)差異在疾病發(fā)生中的具體調(diào)控機(jī)制。

［1］Hobert O.Gene regulation by transcription factors and microRNAs［J］.Science，2008，319(5871):1785 －1786.

［2］Rong H，Liu TB，Yang KJ，et al.MicroRNA －134 plasma levels before and after treatment for bipolar mania［J］.J Psychiatr Res，2011，45(1):92 －95.

［3］Fichtlscherer S，De Rosa S，F(xiàn)ox H，et al.Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease［J］.Circ Res，2010，107(5):677 －684.

［4］魏 聰，胡 兵，申 鍔.MicroRNAs在心臟發(fā)育和疾病中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(3):611－615.

［5］Zheng L，Xu CC，Chen WD，et al.MicroRNA －155 regulates angiotensin II type 1 receptor expression and phenotypic differentiation in vascular adventitial fibroblasts［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，400(4):483 －488.

［6］Griffiths－Jones S，Saini HK，van Dongen S，et al.miRBase:tools for microRNA genomics［J］.Nucleic Acids Res，2008，36(Suppl 1):D154 － D158.

［7］Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases［J］.Cell Res，2008，18(10):997－1006.

［8］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood－based markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(30):10513－10518.

［9］Yamada M，Kim S，Egashira K，et al.Molecular mechanism and role of endothelial monocyte chemoattractant protein－1 induction by vascular endothelial growth factor［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(11):1996－2001.

［10］張玉英，范維琥，馬宇瀅，等.心肌梗死大鼠缺血心肌中內(nèi)皮抑素的表達(dá)［J］.中國病理生理雜志，2006，22(10):1957－1959.

［11］Inoue M，Itoh H，Ueda M，et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)expression in human coronary atherosclerotic lesions:possible pathophysiological significance of VEGF in progression of atherosclerosis［J］.Circulation，1998，98(20):2108 －2116.

［12］尹瑞興，馮建章，姚 震.急性心肌梗死大鼠血清血管內(nèi)皮生長因子含量的變化［J］.中國病理生理雜志，2000，16(1):30－32.