王春鋒 李濟(jì)宇 (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院普外科,上海200092)

過(guò)去對(duì)肥大細(xì)胞(Mast cell,MC)的研究多關(guān)注于其在超敏反應(yīng)像支氣管哮喘、接觸性皮炎等疾病中的作用[1]。自從2006年LU等[2]首次發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞缺陷小鼠難以誘導(dǎo)皮膚移植耐受,輸注骨髓源性MC重建MC正常鼠移植耐受得以誘導(dǎo),證明了肥大細(xì)胞在器官移植耐受中的關(guān)鍵作用[3]。MC參與免疫耐受的相關(guān)機(jī)制尚不明確,近年研究多關(guān)注其與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)的相互作用,且更多關(guān)注Treg對(duì)MC的作用,MC對(duì)Treg的研究較少,對(duì)其他免疫相關(guān)細(xì)胞的研究也較少[4,5]。體外獲得大量高純度的肥大細(xì)胞可以幫助我們更好的研究其在移植免疫耐受領(lǐng)域的作用。然而骨髓來(lái)源的MC所需培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),需要在特定細(xì)胞因子下誘導(dǎo)分化,所需的費(fèi)用較高,因此,本研究通過(guò)采取七天換液的方式來(lái)觀察是否可以獲得同樣高純度的MC。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠8～10周齡,清潔級(jí),購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SCXK(滬)2007-0005。

1.2 主要試劑 小鼠重組IL-3、SCF(Peprotech);RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、非必需氨基酸(Invitrogen);PE-CD117、FITC-FCεR Ⅰα(eBioscience)、PE-murine control mIgG1(eBioscience);甲苯胺藍(lán)(上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞的獲得 取小鼠的股骨,剔除其肌肉組織,剪斷兩端骨骺,用1 ml注射器抽取RPMI1640培養(yǎng)基,將骨髓細(xì)胞沖出,直至骨髓腔變白,加入到培養(yǎng)體系中,培養(yǎng)體系含RPMI1640、10%胎牛血清、青鏈霉素各100U/ml、50μmol/L非必需氨基酸、10 ng/ml rmIL-3(recombinant murine IL-3)、10 ng/ml rmSCF(recombinant murine SCF)。

1.4 小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞的培養(yǎng) 將上述細(xì)胞按照106ml-1接種于六孔板中,每孔3 ml培養(yǎng)基,置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每七天將懸浮細(xì)胞按照106ml-1轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng),4～6細(xì)胞分化成熟,四周后收集細(xì)胞進(jìn)行鑒定,分別從形態(tài)學(xué)、功能學(xué)兩方面來(lái)驗(yàn)證所獲得的細(xì)胞為肥大細(xì)胞。

1.5 肥大細(xì)胞的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 主要是通過(guò)光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),以及借用于流式細(xì)胞儀來(lái)觀察細(xì)胞表面CD117和FCεRⅠα的表達(dá)。具體方法為六周后收集培養(yǎng)細(xì)胞,離心,PBS重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為106ml-1,每管取100μl,分別加入0.5 μl的PE-CD117,0.2μl的FITC-FCεRⅠα,其中雙染的同時(shí)加入兩種抗體,陰性對(duì)照組加入PE-mIgG1,4℃避光孵育30分鐘,用PBA(含 2.5%FBS的PBS)洗兩次,上機(jī)檢測(cè)。

1.5.2 功能學(xué)鑒定 肥大細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色:六周后將細(xì)胞懸液滴到防脫片(包被有多聚賴氨酸)上,超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干,用1%pH7.4的甲苯胺藍(lán)染液染約30秒,用95%的酒精分色,雙蒸水洗滌后,于光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下肥大細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察以及四周后光鏡下的肥大細(xì)胞 培養(yǎng)48小時(shí)后開(kāi)始出現(xiàn)貼壁細(xì)胞,為長(zhǎng)梭形,視野中可見(jiàn)大小不一的懸浮細(xì)胞,隨著換液次數(shù)的增加,貼壁細(xì)胞越來(lái)越少,懸浮細(xì)胞逐漸增多,變?yōu)榇笮?、形狀、分布均勻具有折光性的?xì)胞,高倍鏡下(10×40)可以看見(jiàn)胞膜邊緣有絲狀突起。四周以后這種大小均一的折光性細(xì)胞占95%以上,見(jiàn)圖1。

2.2 透射電鏡下觀察肥大細(xì)胞 電鏡下發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞胞體大部分呈橢圓形或不規(guī)則形,表面有偽足,胞內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器,如線粒體、游離核糖體、高爾基復(fù)合體等,胞漿內(nèi)充滿大量高電子密度顆粒,有些肥大細(xì)胞在未受任何刺激的情況下也會(huì)發(fā)生脫顆粒,可見(jiàn)大量脫顆粒后的空泡(如圖2D)。鏡下可見(jiàn)明顯的核仁,異染色質(zhì)附于核膜下,見(jiàn)圖2。

圖1 培養(yǎng)四周后光鏡下的肥大細(xì)胞Fig.1 Characteristic of mast cells after 4 weeks'cultureunder light microscope

圖2 不同倍數(shù)電鏡下的骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞Fig.2 Characteristic of mast cells after 4 weeks'cultureunder transmission electron microscope

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞的表面 CD117和FCεRⅠα的表達(dá)Fig.3 CD117 and FCεRⅠαexpression on mast cell surface by flow cytometry analysis

圖4 骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色Fig.4 Toluidine bluestaining of bone marrow mast cells

2.3 流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)分析肥大細(xì)胞 四周后收集肥大細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面分子CD117和FCεRⅠα的表達(dá)情況,單陽(yáng)性表達(dá)CD117和FCεRⅠα的細(xì)胞達(dá)到90%以上,見(jiàn)圖3A、B,雙陽(yáng)性表達(dá)這兩種表面分子的細(xì)胞達(dá)81%,見(jiàn)圖3C。

2.4 肥大細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色 培養(yǎng)四周后,用甲苯胺藍(lán)染色,可以觀察到細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色,胞核染成藍(lán)色。證實(shí)該細(xì)胞有吞噬甲苯胺藍(lán)的特性,所獲得的細(xì)胞為肥大細(xì)胞,見(jiàn)圖4。

3 討論

IL-3和SCF都是肥大細(xì)胞分化和增殖所必需的細(xì)胞因子[6]。在骨髓前體細(xì)胞向肥大細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中,一方面,IL-3和SCF在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用;另一方面,肥大細(xì)胞作為懸浮細(xì)胞的特性進(jìn)一步將其與骨髓中的其他細(xì)胞(大部分為貼壁細(xì)胞)純化開(kāi)來(lái)。很多研究認(rèn)為在肥大細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中每四天換液可以獲得較純化的細(xì)胞[7]。而我們的研究發(fā)現(xiàn),在四周左右時(shí)七天換液的細(xì)胞較四天換液的細(xì)胞純度更高(CD117、FCεRⅠα雙陽(yáng)性率更高),而細(xì)胞的生存活力和細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有明顯的差異。分析原因可能是肥大細(xì)胞作為懸浮細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基更換的頻率沒(méi)有那么高,再者肥大細(xì)胞的壽命比較長(zhǎng),一些貼壁細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求較高,在七天的時(shí)間內(nèi)大部分死亡,換液過(guò)程中純化出了培養(yǎng)體系。通過(guò)這種方法,我們可以更經(jīng)濟(jì)、更快速的獲得純化的肥大細(xì)胞。這種方式獲得的肥大細(xì)胞的壽命很長(zhǎng),一般培養(yǎng)十周左右細(xì)胞走向凋亡過(guò)程。

本研究通過(guò)將骨髓細(xì)胞直接沖出接種于培養(yǎng)基中,每七天換液的方式獲得了大量CD117和 FCεRⅠα表達(dá)雙陽(yáng)性的細(xì)胞,即為肥大細(xì)胞。通過(guò)形態(tài)學(xué)和功能學(xué)兩方面鑒定了培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞為肥大細(xì)胞,相對(duì)于四天換液明顯節(jié)省了人力和財(cái)力,成為一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的體外獲得大量肥大細(xì)胞的方法,可以更好的研究其在移植免疫領(lǐng)域的作用。

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