朱艷芬 宋澤慶 (廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,湛江524000)

氣道重塑是哮喘的重要特征,與重癥哮喘密切相關(guān),特征性改變是上皮下纖維化和氣道平滑肌細(xì)胞(Airway Smooth Muscle Cells,ASMC)增生肥大[1,2]。氣道重塑一旦形成難以可逆,目前臨床上尚缺乏簡單可行的檢測和治療方法,所以氣道重塑成為哮喘防治的難點和重點。α-SMA是肌纖維細(xì)胞亞類之一,也是平滑肌的主要標(biāo)志物,可反映平滑肌數(shù)量及其收縮能力,具有收縮潛能和較強的膠原合成能力,可導(dǎo)致管腔收縮狹窄,哮喘發(fā)作。α-SMA表達(dá)增加可能與哮喘氣道重塑,哮喘癥狀發(fā)作有密切關(guān)系。本研究旨在探討人類主要過敏原屋塵螨提取液(House Dust Mite Extract,HDM)誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中肺組織中α-SMA與哮喘氣道重塑的關(guān)系,為臨床支氣管哮喘診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑 6～8周雌性SPF級BALB/c小鼠廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,合格證號2008A040。標(biāo)準(zhǔn)化的HDM,購自丹麥ALK公司,產(chǎn)品號ALK(503),主要成分是Derp1和Derp2,含量為1×108U/L。兔抗小鼠α-SMA多克隆抗體、免疫組化超敏SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;PCR 引物 、GAPDH 內(nèi)參、Trizol、RT-PCR Kit、SYBR Green PCRMaster Mix等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 動物分組 SPF級雌性BALB/c小鼠90只,體質(zhì)量(18±2)克,隨機分為空白對照組、HDM 低劑量組和HDM 高劑量組,每組再分為 3、6、9周三個亞組,每亞組均為10只動物。

1.3 致敏和激發(fā)步驟 參考Ahn的模型構(gòu)造方法[3],并做適當(dāng)調(diào)整。HDM低劑量組和HDM高劑量組分別用含2%氫氧化鋁2×106U/L HDM和2%氫氧化鋁4×106U/LHDM 0.05ml,第1天皮下注射致敏小鼠,第8、15天腹腔注射同樣濃度和劑量的HDM。第17天開始,用1%戊巴比妥0.15 ml腹腔注射麻醉小鼠后,HDM低劑量組用2×106U/L和HDM高劑量組用4×106U/L的HDM 0.05 ml緩慢滴鼻激發(fā),每周一、三、五共3次。最后3天每天1次激發(fā),劑量和濃度同前,總計致敏和激發(fā)時間分別達(dá)到3、6和9周。空白對照組致敏和激發(fā)步聚同實驗組,以0.01 mol/L的PBS替代HDM。最后1次滴鼻激發(fā)后24小時,進行以下操作。

1.4 肺組織病理改變 取小鼠肺組織,固定于10%甲醛溶液中過夜,石蠟包埋,切片HE染色,在40倍鏡下觀察肺組織的大體觀,選定病變的視野,在200倍光鏡下觀察肺組織病理改變并進行炎性計分[3]。200倍光鏡下找到5個完整的支氣管橫斷面,且氣管最小直徑/最大直徑≥0.5,參照文獻[4]。通過MetaMorph圖像分析軟件測量支氣管內(nèi)周長(Internal Perimeter,Pi)、氣道內(nèi)徑(Internal Diameter,D1)、氣道外經(jīng)(Outer Diameter,D2)、測量結(jié)果用內(nèi)周長進行標(biāo)準(zhǔn)化,氣道內(nèi)外徑比值為D1/D2。400倍光鏡下采集5處視野,計數(shù)支氣管周圍單位氣道面積(2 200μm2)內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)目,以評估氣道炎癥。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測肺組織中α-SMA表達(dá)量 免疫組織化學(xué)染色法步驟按SP說明書進行,光學(xué)顯微鏡下觀察組織著色情況,α-SMA蛋白陽性反應(yīng)呈淡黃色至棕褐色,定位于細(xì)胞質(zhì)。無著色為陰性,淡棕黃色為弱陽性,棕黃色為陽性,深棕黃色為強陽性。通過MetaMorph圖像分析軟件測量,以固定顏色模式界定平滑肌,測定平滑肌面積(Area of Smooth Muscle of Bronchial-Wall,WAm),支氣管內(nèi)周長(Internal Perimeter,Pi)并計數(shù)其被染色的平滑肌細(xì)胞核數(shù),測量結(jié)果用內(nèi)周長進行標(biāo)準(zhǔn)化,平滑肌厚度表示為WAm/Pi,ASMC細(xì)胞核數(shù)表示為N/Pi。

1.6 qRT-PCR法檢測肺組織中α-SMA基因表達(dá) 目的基因qm-α-SMA,F5′-gtggtcaggaatagatgtg-3′,R5′-ctagctgtgaagtcagtgt-3′(193 bp);內(nèi)參照 18SrRNA,qm-α-SMA,F5′-ggatggcatcaatcacttc-3′,R5′-gcatatccatgcacgtgt-3′(112 bp)。實時定量 PCR樣品反應(yīng)體系采用SYBR Green I,其最終的反應(yīng)體系為20μl,循環(huán)條件為:95℃10分鐘、95℃ 15 秒、72℃ 30秒、60℃15秒,40個循環(huán)后,繪制18S rRNA、α-SMA的熒光擴增曲線和溶解曲線,并得到各自的熒光域值循環(huán)數(shù)(Ct值),計算其均值的比值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 炎性病理計分采用中位數(shù)(全距)表示,其余數(shù)據(jù)以±s表示,實驗數(shù)據(jù)資料采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型的構(gòu)建成功 通過對小鼠反應(yīng)性觀察,HDM高劑量和HDM低劑量組小鼠不同程度上表現(xiàn)出毛色欠光澤,食欲下降、大小便失禁、煩躁不安、喘息、呼吸困難甚至死亡等哮喘癥狀;測定肺泡灌洗液中IL-4和血清總IgE,HDM高劑量和HDM低劑量組也有相應(yīng)升高,表明哮喘模型構(gòu)建成功[5]。

2.2 肺的病理組織學(xué)檢測 HDM高劑量組3周時支氣管粘膜水腫、支氣管粘膜下和周圍肺組織有明顯的炎細(xì)胞浸潤,隨時間增加,氣道重構(gòu)和肺氣腫現(xiàn)象顯著,炎性病理計分明顯升高;HDM低劑量組炎性病理計分升高,但炎細(xì)胞浸潤,氣道重構(gòu)等改變較HDM高劑量組輕微;空白組均未見明顯炎細(xì)胞浸潤及氣道重構(gòu)改變(見表1)。與空白組對比,HDM高、低劑量組在3、6、9周時氣道D1/D2明顯減小,炎性細(xì)胞數(shù)目增加。與HDM低劑量組對比,HDM高劑量組3周時炎性細(xì)胞改變有統(tǒng)計學(xué)差異;隨時間增加D1/D2有下降趨勢,炎性細(xì)胞有增加趨勢,但改變無統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

表1 塵螨致敏小鼠肺組織病理炎癥計分中位數(shù)(全距)Tab.1 Histopathological scores mean of murine pulmonary inflammation sensitized by HDM with range in parenthesis(Range)

2.3 肺組織中α-SMA表達(dá)的變化 α-SMA表達(dá)陽性細(xì)胞為胞漿呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒。HDM高劑量組中可見支氣管壁上ASMC和血管平滑肌存在大量被染成褐色α-SMA強陽性反應(yīng)細(xì)胞,同時可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤;HDM低劑量組可見α-SMA免疫反應(yīng)呈陽性反應(yīng),少量炎細(xì)胞浸潤;空白組呈弱陽性反應(yīng),未見到明顯炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象(如圖1～3)。通過定量分析,與空白組對比,HDM高劑量組在3周時開始Wam/Pi、N/Pi顯著增加;而HDM 低劑量組在6周時開始增加顯著,隨時間的延長,改變越來越顯著。HDM高劑量組比低劑量組增加顯著,(如表3)。

表2 塵螨致敏小鼠支氣管炎細(xì)胞數(shù)、內(nèi)外徑比值的變化( ±s)Tab.2 Thecharacteristic of inflammation cells,D1/D2 in mice(±s)

表2 塵螨致敏小鼠支氣管炎細(xì)胞數(shù)、內(nèi)外徑比值的變化( ±s)Tab.2 Thecharacteristic of inflammation cells,D1/D2 in mice(±s)

Note:Compared with control,1)P＜0.05,2)P＜0.01;compared with low dose,3)P＜0.01.

Group n Cells(n/μm2)D1/D2(μm/μm)(t/week) Control 9 15.50±2.52 0.73±0.05 3 L-DHM 8 24.75±1.892) 0.65±0.091)H-DHM 7 29.75±3.092)3)0.58±0.102)Control 9 15.75±1.89 0.65±0.06 6 L-DHM 8 28.33±2.522) 0.49±0.142)H-DHM 7 28.00±2.552) 0.52±0.131)Control 9 14.70±2.50 0.69±0.08 9 L-DHM 8 32.50±2.082) 0.51±0.101)H-DHM 7 26.00±3.462) 0.50±0.172)

圖1 3周時α-SMA在各組中的表達(dá)(×400)Fig.1 Expression ofα-SMA in various groups in three-week(×400)

圖2 6周時α-SMA在各組中的表達(dá)(×400)Fig.2 Expression ofα-SMA in various groups in six-week(×400)

圖3 9周時α-SMA在各組中的表達(dá)(×400)Fig.3 Expression ofα-SMA in various groups at nine-week(×400)

表3 塵螨致敏小鼠氣道平滑肌面積(WAm/Pi)和平滑肌細(xì)胞(N/Pi)的變化±s)Tab.3 The characteristic of WAm/Pi and N/Pi in mice sensitized by HDM(±s)

表3 塵螨致敏小鼠氣道平滑肌面積(WAm/Pi)和平滑肌細(xì)胞(N/Pi)的變化±s)Tab.3 The characteristic of WAm/Pi and N/Pi in mice sensitized by HDM(±s)

Note:Compared with control,1)P＜0.05,2)P＜0.01;Compared with low dose,3)P＜0.05,4)P＜0.01;Compared with 3-week,5)P＜0.05.

Group n WAm/Pi(μm2/μm)N/Pi(n/μm2)(t/week) Control 9 2.18±0.17 4.06±0.33 3 L-DHM 8 2.37±0.25 4.42±0.56 H-DHM 7 2.99±0.891) 5.99±1.772)3)Control 9 2.13±0.16 4.25±0.31 6 L-DHM 8 3.12±1.061) 6.04±1.875)H-DHM 7 4.45±0.472)4) 8.89±0.932)4)Control 9 2.14±0.17 4.20±0.37 9 L-DHM 8 3.33±0.802) 6.54±1.62)5)H-DHM 7 4.58±0.532)4)5)9.16±1.252)4)5)

表4 塵螨致敏小鼠后肺組織α-SMA mRNA表達(dá)的變化(±s)Tab.4 The expression ofα-SMA mRNA in mice sensitized by HDM(±s)

表4 塵螨致敏小鼠后肺組織α-SMA mRNA表達(dá)的變化(±s)Tab.4 The expression ofα-SMA mRNA in mice sensitized by HDM(±s)

Note:Compared with control,1)P＜0.01;Compared with low dose,2)P＜0.05,3)P＜0.01;Compared with 3-week,4)P＜0.05.

Group n α-SMA mRNA(2-△△CT)(t/week)3 6 9 Control 9 2.11±0.86 2.16±0.87 2.39±0.61 L-DHM 8 2.97±0.40 4.50±0.31)4) 4.76±0.621)4)H-DHM 7 4.15±0.391)2) 5.97±0.511)3)4) 6.32±0.761)2)4)

2.4 肺組織中α-SMA mRNA含量的變化 RNA電泳可見三條清晰條帶表明提取RNA完整。與空白組對比,HDM高、低劑量組肺組織中α-SMA mRNA表達(dá)顯著增加,隨時間延長增加越來越顯著;HDM高劑量組比HDM低劑量組增加顯著(見表4)。

3 討論

氣道重塑是嚴(yán)重哮喘和難治性哮喘的主要病理基礎(chǔ),也是哮喘防治的難點及熱點。通過圖像測量和病理炎性計分表明:3周時炎細(xì)胞浸潤顯著,6周時氣道重塑顯著,9周時氣道破壞嚴(yán)重。該結(jié)果可由哮喘發(fā)展過程解釋,小鼠受過敏原反復(fù)刺激3周時出現(xiàn)典型的哮喘氣道變應(yīng)性炎癥,并出現(xiàn)輕微氣道重塑現(xiàn)象。隨時間增加反復(fù)過敏原刺激導(dǎo)致氣道炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y持續(xù),平滑肌肌層肥厚,上皮細(xì)胞下纖維化、基底膜增厚等氣道重塑改變越來越顯著;9周時在嚴(yán)重氣道重塑基礎(chǔ)上出現(xiàn)肺泡間隔斷裂形成肺大泡肺氣腫征,表現(xiàn)為外周肺氣腫嚴(yán)重,中心大氣道壁增厚堵塞。Johnson等[6]和Kristina等[7]研究表明:屋塵螨誘導(dǎo)的哮喘小鼠滴鼻接觸7周后能導(dǎo)致膠原沉積,上皮下纖維化,平滑肌細(xì)胞增殖,血管增生等病理改變,與本研究結(jié)果一致。HDM低劑量組3周時僅部分測量指標(biāo)有顯著意義,6、9周相對改變較明顯。表明HDM高劑量組成功誘導(dǎo)穩(wěn)定的氣道重構(gòu)模型,HDM低劑量模型相對不穩(wěn)定。

支氣管平滑肌增生肥大是慢性哮喘氣道重塑的特征性改變,α-SMA是平滑肌的主要標(biāo)志物,其含量對平滑肌的收縮能力具有較大影響,可反映平滑肌數(shù)量及其收縮能力的改變。哮喘氣道慢性炎癥能刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞,此類轉(zhuǎn)變表型的肌成纖維細(xì)胞能夠促進α-SMA表達(dá)。本研究中,采用IH和qRT-PCR檢測小鼠氣道重塑的重要指標(biāo)α-SMA蛋白和基因的表達(dá)。結(jié)果顯示HDM高、低劑量組中可見支氣管壁上被染成棕褐色α-SMA陽性反應(yīng)細(xì)胞 ,Wam/P、N/Pi和 α-SMA mRNA 增加,同時可見炎癥細(xì)胞浸潤,與氣道重塑改變一致。該結(jié)果說明:(1)哮喘小鼠的支氣管壁發(fā)生了結(jié)構(gòu)上的改變,出現(xiàn)了具有特征性改變的α-SMA的平滑肌細(xì)胞,具有較強的收縮能力,較易發(fā)生氣道痙攣和氣流受限,形成AHR[8];(2)氣道壁平滑肌面積和單位面積平滑肌細(xì)胞增加,表明氣道平滑肌細(xì)胞同時產(chǎn)生肥大和增生;(3)α-SMA mRNA顯著增加,肌成纖維細(xì)胞亦表達(dá)α-SMA mRNA。哮喘氣道上皮下纖維化時成纖維細(xì)胞增生亦可能使α-SMA表達(dá)增加;同時,成纖維細(xì)胞遷徙并轉(zhuǎn)化為具有收縮能力的肌成纖維細(xì)胞,亦可能增加α-SMA mRNA表達(dá)[9]。

綜上所述,HDM能成功誘導(dǎo)小鼠哮喘氣道重塑模型,氣道重塑在哮喘早期已經(jīng)出現(xiàn),并隨著與過敏原接觸時間延長越來越嚴(yán)重。α-SMA隨氣道重塑出現(xiàn)表達(dá)增強,可能與氣道平滑肌細(xì)胞增生肥大以及肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及其相互作用有關(guān)。α-SMA表達(dá)的增加可導(dǎo)致氣道痙攣、狹窄及粘液分泌增多,進而導(dǎo)致AHR,加劇哮喘癥狀和疾病的發(fā)展。因此從肺組織中α-SMA表達(dá)來診斷和干預(yù)哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展將為哮喘的診治提供新的理論依據(jù)。

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5 朱艷芬,宋澤慶.支氣管哮喘氣道重構(gòu)模型的構(gòu)建及評價[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010;36(1):99-103.

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