朱思思 趙肅清 李月明 溫俊林 (廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院,廣州510006)

腸道病毒71型是細小RNA病毒科,腸道病毒屬,自1974年首次報道以來,已在全世界范圍內(nèi)多次爆發(fā)和流行[1,2]。EV71感染除了能引起手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)外,還能引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的嚴(yán)重疾病如腦干腦炎、無菌性腦膜炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹[3]。然而目前針對腸道病毒EV71感染仍沒有有效的預(yù)防疫苗及治療特效藥。近年來,卵黃抗體(egg yolk immunoglobulin Y,IgY)因其具有經(jīng)濟、安全、制備方便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點而成為當(dāng)今生物科學(xué)研究的一個熱點[4]。IgY抗體在動物與人的被動免疫保護方面的應(yīng)用引起了廣泛的關(guān)注。國內(nèi)外已有一些關(guān)于抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、抗流感病毒、抗甲肝病毒IgY抗體的研究報道[5-7]。本研究的目的在于制備與鑒定特異性抗EV71病毒的IgY抗體并檢測其生物學(xué)性能,為EV71感染手足口病的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 高速冷凍離心Allegra TM 64R Centrifuge(Beckman,America);酶標(biāo)分析儀Tecan infinite 200(Tecan,Switzerland);生物安全柜NE-430-600E(NUAIRE,America);真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司);HRP標(biāo)記山羊抗雞IgY二抗為Promega公司產(chǎn)品;弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、四甲基聯(lián)苯胺(Tetrabenzidine,TMB)購自Sigma公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均為Gibco公司產(chǎn)品;CsCl為MERCK公司產(chǎn)品;PEG6000為日產(chǎn)購自廣東國奧生物科技公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗動物 廣州太和良田養(yǎng)雞場健康產(chǎn)蛋母雞4只,未經(jīng)任何免疫,正常飼養(yǎng)。

1.1.3 實驗抗原 EV71腸道病毒廣東惠州株由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 方法

1.2.1 抗原的純化 將EV71病毒株接種到生長至單層的橫紋肌肉瘤細胞RD細胞中,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90%左右細胞出現(xiàn)細胞病變CPE時收獲,-20℃凍融3次,4℃,10 000 r/min離心90分鐘,收集上清液。上清液經(jīng)4℃,26 000 r/min離心3小時,棄上清,沉淀用PBS緩沖液懸浮。CsCl密度梯度離心,4℃45 000 r/min離心3小時,棄上清去除殘余CsCl,加入少量PBS稀釋純化后病毒液,56℃高溫滅活,4℃保存。

1.2.2 免疫方法 取純化后的EV71病毒原液與弗氏完全佐劑等體積混合,乳化充分后按200μl/只的抗原量經(jīng)肌肉多點注射免疫實驗雞;然后分別在一免后14、24、34天分別進行三次加強免疫,加強免疫用弗氏不完全佐劑與病毒液等體積乳化,免疫方法和劑量與首免相同。首免后第7天開始收集每日雞蛋,編號4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ占庖咔半u蛋及血清為陰性對照。

1.2.3 卵黃抗體的分離純化 將收集的雞蛋破殼,收集蛋黃并在無菌定性濾紙上滾動以除去殘留卵白蛋白,破卵黃膜收集卵黃液,測卵黃液體積并平分兩份,提取純化方法分別采用PEG三步沉淀法及本實驗室改良的水提綜合PEG法純化蛋白[8]:加卵黃液9倍體。積的4℃凍存蒸餾水,調(diào)pH值至5.2,充分?jǐn)噭蚝蠓?℃靜置過夜。4℃,10 000 r/min離心20分鐘,過濾,棄沉淀。上清液中加入PEG6000粉末使其終濃度為8.5%,調(diào)pH值至7.2,充分混勻后4℃,10 000 r/min離心20分鐘,棄上清液。沉淀用適量4℃PBS緩沖液(0.01 mol/L,pH7.2)溶解后再加入PEG6000至終濃度為12%,10 000 r/min,4℃離心20分鐘,棄上清。再用少量PBS溶解沉淀,轉(zhuǎn)入透析袋(分子截留量14 kD),透析24小時以上,收集透析液,-56℃真空冷凍干燥至粉末,-20℃保存。

1.2.4 卵黃抗體純度及含量檢測 參照文獻[9]用考馬斯亮藍G-250染色法測定IgY純化后凍干粉中總蛋白含量。還原性SDS-PAGE凝膠電泳(5%濃縮膠、15%分離膠)分析IgY的純度,凝膠成效掃描分析計算總蛋白中IgY含量。

1.2.5 間接ELISA法檢測卵黃抗體效價 將純化過的EV71病毒抗原用0.01 mol/LPBS1∶1 000稀釋后包被于96孔酶標(biāo)板上(100μl/孔),37℃溫浴1小時后,4℃過夜。用含3%脫脂奶粉的0.01 mol/L PBS液封閉(100μl/孔),37℃溫浴1小時。卵黃抗體IgY用0.01 mol/L PBS倍比系列稀釋后加入96孔酶標(biāo)板(100μl/孔),37℃溫浴反應(yīng)1小時后加入酶標(biāo)二抗HRP-GAM IgY(100μl/孔),37℃溫浴 1小時。用TMB顯色液顯色約15分鐘后2 mol/LH2SO4溶液終止反應(yīng)(50μl/孔),立即用酶標(biāo)儀測定OD450nm處吸光值。以免疫雞IgY與未免疫雞陰性IgY OD450nm吸光值之比大于2.1,且陰性IgY吸光值大于0.1作為抗體陽性的判定閥值。

1.2.6 免疫雙向瓊脂擴散檢測 瓊脂糖與PEG6000各1 g溶于100 ml生理鹽水,煮沸至透明,趁熱倒入潔凈培養(yǎng)皿中,每平皿約18～20 ml,加蓋置平臺。待其冷卻凝固后用打梅花樣孔,孔徑約4 mm,孔距約3 mm。用針頭小心挑出孔內(nèi)瓊脂糖,封閉孔底。

往中心孔加入一定量抗原原液,外周孔加入等量不同稀釋倍數(shù)的抗體IgY溶液。靜置至孔內(nèi)樣液完全吸入瓊脂中,將培養(yǎng)皿倒置平放于濕盒內(nèi),37℃恒溫水浴,24～48小時后觀察結(jié)果。

1.2.7 免疫印跡(Western blot)分析卵黃抗體的特異性 將SDS-PAGE凝膠電泳分離的EV71病毒蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜,室溫下以含5%脫脂奶粉的TBST為封閉液,純化IgY為一抗,HRP標(biāo)記山羊抗雞IgY為二抗,增敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色。同時設(shè)定陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 IgY的提取 BSA的Bradford法標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,得蛋白濃度計算公式Y(jié)=0.008 3X+0.036,R2=0.990 5。計算得水提綜合PEG法和PEG三步沉淀法兩種不同提取方法提取的凍干粉中蛋白含量分別為89.64%、85.90%。

由SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2)可見目的蛋白在還原條件下二硫鍵打開,分裂約64 kD的IgY重鏈和26 kD的IgY輕鏈。WSF中含有大量雜蛋白;經(jīng)3.5%和8.5%PEG兩步沉淀法提取的沉淀蛋白中仍含有一定量40 kD的β活性蛋白;而由水提綜合PEG法、PEG三步沉淀法提取蛋白中雜蛋白大量減少,IgY純度顯著提高,凝膠成像系統(tǒng)軟件分析IgY抗體純度分別為94.86%和92.56%。同時由表1可知,水提綜合PEG法提取IgY產(chǎn)量達7.76 mg/ml,而PEG三步沉淀法提取IgY產(chǎn)量僅為3.96 mg/ml。

2.2 ELISA檢測IgY效價及消長規(guī)律 抗EV71病毒IgY抗體ELISA檢測效價變化規(guī)律如圖3。蛋雞初免約10天后蛋黃中可檢測到特異性卵黃抗體,加強免疫后特異性IgY效價呈明顯的增長趨勢。初免約40天后抗體效價達最高1∶20 480,此高效價大約維持30天后抗體效價水平開始逐步下降。

2.3 免疫雙向瓊脂擴散 以雙向免疫瓊脂擴散法檢測初免后第40天特異性抗EV71病毒IgY抗體效價。結(jié)果如圖4,當(dāng)抗體以1∶16稀釋時,抗原孔與抗體孔之間仍出現(xiàn)顯著白色沉淀線,而PBS空白對照孔與抗原孔之間無沉淀線。

2.4 Western blot分析 抗EV71病毒IgY Western blot分析結(jié)果(如圖5)顯示能特異性地與EV71病毒蛋白條帶產(chǎn)生良好免疫反應(yīng)。如圖5所示抗EV71病毒IgY與EV71病毒蛋白在約38、36、24 kD出現(xiàn)特異性結(jié)果條帶,由文獻[10]可知,相對分子量為36、24 kD左右的蛋白條帶分別為EV71病毒的VP1(α)、VP3蛋白。而陰性IgY與EV71病毒不具有免疫反應(yīng)性,圖中沒有特異性結(jié)合的蛋白條帶出現(xiàn)。

表1 兩種提取方法提取卵黃抗體產(chǎn)量及純度對比表Tab.1 Comparetheyield and purity of IgY extracted by PEG method and Water-PEG method

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of protein

圖2 純化IgY的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE patterns of IgY purified by three methods

圖3 抗EV71病毒IgY抗體效價消長規(guī)律Fig.3 The development pattern of anti-EV71 IgY after primary immunization

圖4 雙向免疫瓊脂擴散Fig.4 Agar double immunodiffusion

圖5 蛋白印跡分析抗EV71病毒IgYFig.5 Western blot analysis the immunoreactivity of IgY anti-EV71

3 討論

目前,提取IgY常用方法主要有水提硫酸銨沉淀法、PEG三步沉淀法等[11]。水提硫酸銨沉淀法獲得卵黃抗體的產(chǎn)量大,純度高,但實驗周期長,硫酸銨消耗量大,成本高,不適合實驗室小型研究;而PEG三步沉淀法雖實驗周期短,但提取IgY產(chǎn)量低,浪費嚴(yán)重。本研究采用綜合以上兩種提取方法的水提綜合PEG法,并成功獲得抗EV71的特異性IgY抗體,操作步驟簡便快捷,實驗成本低、周期短,得到的卵黃抗體純度高達94.83%,產(chǎn)量達7.76 mg/ml,明顯高于PEG三步沉淀法得92.56%和3.96 mg/ml。

EV71病毒顆粒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu),直徑約24～30 nm,病毒顆粒的衣殼組成非常復(fù)雜,分子量分別為34、30、26和7 kD的四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1(α)、VP2(β)、VP3(γ)、VP4(δ)中,除 VP4 包埋在病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接以外,其他三種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒顆粒的表面,因而抗原決定簇基本上位于VP1-VP3上[10]。本研究Western blot分析顯示相對分子量為36、24 kD左右的蛋白條帶分別為純化EV71病毒的VP1、VP3蛋白。

EV71病毒顆粒沒有類脂性的包膜,對一般去污劑、75%乙醇、5%甲酚皂溶液等常見消毒液等具有抵抗力,這些都決定了該病毒較強的野外生存能力[12,13]。EV71病毒耐酸、耐熱,極易在濕熱環(huán)境下傳播繁殖,然而對高溫(50℃以上)及紫外線的抵抗能力較差。以EV71病毒為常見病原體的手足口病是一種全球性的傳染病,其在世界范圍內(nèi)的傳播流行給社會造成了極大的恐慌。如今預(yù)防EV71感染的疫苗還在研制中,同時仍沒有治療由EV71感染所致疾病的特效藥物。近年來,IgY在診斷和治療應(yīng)用方面的研究在國內(nèi)外都已經(jīng)取得了積極的成果。Wang等[14]研究表明證明了抗金黃色葡萄球菌的卵黃抗體對乳腺炎有治療作用;葉翠蓮等[15]也報道了抗幽門螺桿菌卵黃抗體對幽門螺桿菌感染具有較好治療效果。本研究利用滅活病毒免疫蛋雞所獲得的抗EV71病毒IgY抗體ELISA檢測效價達1∶20 480,具有良好的免疫反應(yīng)性,相對于傳統(tǒng)的哺乳動物抗體制備具有制備簡單、成本低、無需殺害動物等優(yōu)點,為預(yù)防和治療抗EV71藥物提供了基礎(chǔ)。同時,可再深入通過體外中和活病毒實驗和抗EV71動物模型實驗檢測該特異性抗EV71 IgY體內(nèi)外抗病毒的能力。因卵黃抗體安全衛(wèi)生,穩(wěn)定性好,不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶水解失活[16],因此,可通過向飲料及洗手液等產(chǎn)品中添加該特異性抗EV71 IgY,來達到預(yù)防及治療EV71感染。

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