張明峰 周守勤 劉淑霞 彭晨星 郭惠芳 (河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院免疫風濕科,石家莊050000)

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種高度致殘性疾病。采取有效措施控制滑膜組織增生是改善預后,延長患者壽命的關(guān)鍵所在。積極探索療效可靠、毒副作用小、經(jīng)濟適用的緩解病情藥物,也成為了各風濕病學者研究的重點課題之一。三氧化二砷(As2O3)在急性白血病和各類實體瘤的治療中已取得了舉世矚目的成就,并已經(jīng)應用于臨床[1,2]。但其對風濕性疾病的治療作用仍在探索之中。前期體外細胞培養(yǎng)研究顯示,As2O3可通過抑制信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)1信號轉(zhuǎn)導通路,抑制高遷移率族蛋白1誘導的滑膜細胞增殖[3]。本研究借助膠原誘導的關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型進行動物實驗,進一步探討As2O3對滑膜增殖的抑制作用,以及對STAT和細胞因子信號傳導抑制蛋白(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)信號通路的影響,為將來As2O3應用于臨床提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 As2O3(黑龍江伊達藥業(yè)公司生產(chǎn));兔抗大鼠p-STAT1、p-STAT3單克隆抗體(Cell Signaling公司);SOCS1、SOCS3多克隆抗體、羊抗大鼠FITC-IgG二抗(Santa Cruz);小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體(北京中山生物工程公司),破膜劑(美國eBioscience公司);牛Ⅱ型膠原(美國Sigma公司);弗氏完全佐劑(美國Sigma公司);卡介苗(上海生物制品研究所);免疫組織化學SP試劑盒(生物晶美公司);Epics-XLⅡ型流式細胞儀(Beckman Coulter);光學顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 動物模型制備及分組

1.2.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠42只,8～12周齡,體重(160±20)克,購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心,清潔級動物室內(nèi)養(yǎng)殖,室內(nèi)定期進行紫外線照射,所用飼料、水及用具均經(jīng)定期滅菌處理。室溫控制在18～25℃,相對濕度20%～30%。

1.2.2 Ⅱ型膠原乳劑的制備[4]將Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的醋酸中,在4℃下攪拌充分溶解,濃度為2 mg/ml,置4℃冰箱過夜。再與完全弗氏佐劑等體積混合,冰浴下用玻璃攪拌器勻速攪拌,至充分乳化,即乳化液滴入水中無消散,制成Ⅱ型膠原乳劑。

1.2.3 造模方法及分組 將42只Wistar大鼠隨機分成五組,Ⅰ組為正常對照組6只,Ⅱ～Ⅴ組每組各9只用于造模,Ⅱ組為模型對照組,Ⅲ～Ⅴ組分別為低、中、高劑量As2O3治療組。適應性喂養(yǎng)7天,第8天進行造模。每只大鼠的尾根部及背部多點皮內(nèi)注射Ⅱ型膠原乳劑0.2ml初次免疫,第21天腹腔注射乳劑0.2 ml作為二次免疫,第22天開始,對Ⅱ～Ⅴ組大鼠進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分[5],當總評分大于2分時,陸續(xù)開始干預治療,每組給藥6只,其余剔除,造模成功率約70%～80%。采用腹腔注射給藥方法,連續(xù)28天。Ⅰ、Ⅱ組給予等體積的生理鹽水,Ⅲ組:1.0 mg/(kg?d)As2O3治療,Ⅳ組:2.0 mg/(kg?d)As2O3治療,Ⅴ組:4.0 mg/(kg?d)As2O3治療。腹腔給藥容量均為20 mg/kg。

1.3 關(guān)節(jié)標本采集及制作 第50天股動脈取血處死所有大鼠,完整剝離滑膜組織,一并取后肢踝、趾關(guān)節(jié),充分剃去皮毛及肌腱組織,浸泡于4%的多聚甲醛中固定48小時后,浸于20%EDTA脫鈣液中,室溫脫鈣,時間3～4周。由踝關(guān)節(jié)中間縱行剖開,一半用于流式細胞學檢測,一半用于免疫組織化學檢測。后者和滑膜組織(固定24小時)標本均按常規(guī)程序,脫水、透明、石蠟包埋,切片 4μm,貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上,60℃烤片,48小時備用。

1.4 免疫組織化學檢測關(guān)節(jié)組織中PCNA蛋白的表達 切片厚4μm,常規(guī)脫蠟水化,一抗為小鼠抗大鼠PCNA抗體(1∶100稀釋),二抗分別為與一抗相對應的生物素化IgG(1∶100稀釋),以PBS代替一抗作為陰性對照,DAB顯色,光鏡觀察陽性信號。具體步驟按照說明書進行。

1.5 流式細胞術(shù)檢測關(guān)節(jié)組織中PCNA、p-STAT 1/3、SOCS1/3蛋白的表達 將標本用網(wǎng)搓法制成單細胞懸液,取單細胞懸液 1×106ml-1,加入破膜劑,輕微震蕩,孵育15分鐘,離心棄上清;分別加入PCNA、p-STAT1/3、SOCS1/3抗體 100 μl(PCNA 抗體 1∶100稀釋,p-STAT1/3、SOCS1/3抗體為 1∶50稀釋),室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后加入1∶50羊抗大鼠FITCIgG二抗工作液100μl,避光室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后,在Epics-XLⅡ型流式細胞儀進行檢測。設(shè)PBS代替一抗和二抗的陰性對照,以及只加一抗或二抗的陽性對照和同型對照。以熒光指數(shù)(FI)表示待測蛋白的相對含量,公式:FI=(樣品蛋白表達的平均熒光強度-對照樣品平均熒光強度)/正常對照樣品平均熒光強度。

1.6 結(jié)果判定及統(tǒng)計學處理 免疫組織化學結(jié)果判定標準:PCNA蛋白陽性信號表達于細胞核內(nèi),呈棕黃色顆粒者為陽性。計量資料以±s表示,采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行 t檢驗、單因素方差(One-Way ANOVA)分析及Spearman相關(guān)分析,P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 As2O3對大鼠關(guān)節(jié)炎的治療作用 與模型組相比,低、中、高劑量As2O3組關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈劑量依賴性下降(P＜0.01),分別為8.75±1.25、6.19±1.27、3.86±0.44和3.23±0.51;中、高劑量顯著優(yōu)于低劑量組(P＜0.01),見圖1。

2.2 As2O3對關(guān)節(jié)組織PCNA蛋白表達的影響 免疫組織化學顯示:正常對照組,滑膜襯里層散在滑膜細胞的胞核內(nèi)可見棕黃色陽性顆粒,軟骨細胞、血管內(nèi)皮細胞均呈陰性表達;模型組可見大量PCNA蛋白表達陽性的滑膜細胞覆蓋于軟骨表面,并向軟骨下侵蝕,浸潤的炎細胞胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒,少數(shù)受損的軟骨細胞內(nèi)可見淡黃色陽性顆粒。隨著As2O3治療劑量的增加PCNA蛋白陽性的細胞數(shù)目明顯減少(圖2)。

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:模型組PCNA蛋白表達顯著增加,與正常對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);As2O3治療后,CIA大鼠關(guān)節(jié)組織中PCNA蛋白表達顯著下降,接近正常水平(P＜0.01,表1)。

2.3 As2O3對關(guān)節(jié)組織p-STAT1蛋白表達的影響 模型組關(guān)節(jié)組織中p-STAT1表達顯著高于正常對照組(P＜0.01);低、中劑量As2O3治療4周,p-STAT1蛋白表達較模型組明顯下降(P＜0.01和 P＜0.05),但仍高于正常對照組(圖3、表1)。

圖1 As2O3對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響Fig.1 The effect of As2O3 on MAI of CIA rats in different dose groug

圖2 As2O3對 CIA大鼠滑膜組織中PCNA蛋白表達的影響(IHC,×400)Fig.2 The expression of PCNA protein in the synovium detected by IHC(×400)

圖3 FCM檢測AS2O3對滑膜組織中p-STAT1蛋白的表達的影響Fig.3 Histogram of p-STAT1 protein expression in the synovium detected by FCM

表1 As2O3對 CIA大鼠關(guān)節(jié)組織中PCNA、p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3蛋白表達的影響(±s,n=6)Tab.1 The effect of As2O3 on theexpression of PCNA,p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3 proteins of CIA rats articular tissues by FCM( ±s,n=6)

表1 As2O3對 CIA大鼠關(guān)節(jié)組織中PCNA、p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3蛋白表達的影響(±s,n=6)Tab.1 The effect of As2O3 on theexpression of PCNA,p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3 proteins of CIA rats articular tissues by FCM( ±s,n=6)

Note:One-Way ANOVA,1)P＜0.05,2)P＜0.01 vs normal control group;3)P＜0.05,4)P＜0.01 vsmodel control group.

Group PCNA p-STAT1 SOCS1 p-STAT3 SOCS3 Normal control 1.00±0.16 1.00±0.09 1.00±0.08 1.00±0.08 1.00±0.18 Model control 1.26±0.032) 1.27±0.082) 1.18±0.052) 1.27±0.112) 1.24±0.072)As2O3 treated group Low-dose group 1.10±0.104) 1.06±0.084) 1.12±0.031)3) 1.16±0.022)3) 1.18±0.041)Mid-dose group 0.99±0.054) 1.15±0.062)3) 1.17±0.112) 1.19±0.052) 1.21±0.08 High-dose group 1.04±0.094) 1.33±0.122) 1.23±0.102) 1.23±0.092) 1.20±0.111)

圖4 FCM檢測AS2O3對滑膜組織中SOCS1蛋白的表達的影響Fig.4 Histogram of SOCS1 protein expression in the synovium detected by FCM

2.4 As2O3對關(guān)節(jié)組織SOCS1蛋白表達的影響 模型組關(guān)節(jié)組織中SOCS1表達顯著高于正常對照組(P＜0.01);與模型組相比,低劑量組SOCS1蛋白表達減少(P＜0.05),而劑量達 4 mg/(kg?d)后,SOCS1蛋白表達增加,但無統(tǒng)計學意義(圖4、表1)。

圖5 FCM檢測AS2O3對滑膜組織中p-STAT3蛋白的表達的影響Fig.5 Histogram of p-STAT3 protein expression in thesynovium detected by FCM

2.5 As2O3對關(guān)節(jié)組織p-STAT3蛋白表達的影響 模型組關(guān)節(jié)組織中p-STAT3表達顯著高于正常對照組(P＜0.01);低劑量As2O3治療4周,p-STAT3蛋白表達較模型組下降(P＜0.05),但仍高于正常對照組,而中、高劑量組蛋白表達變化與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(圖5、表1)。

2.6 As2O3對關(guān)節(jié)組織SOCS3蛋白表達的影響 模型組關(guān)節(jié)組織中SOCS3表達顯著高于正常對照組(P＜0.01);不同劑量As2O3治療組中,SOCS3蛋白表達量較模型組下降,但均無統(tǒng)計學意義(圖6、表1)。

圖6 FCM檢測AS2O3對滑膜組織中SOCS3蛋白的表達的影響Fig.6 Histogram of SOCS3 protein expression in the synovium detected by FCM

2.7 相關(guān)性分析 低As2O3治療CIA大鼠4周時,p-STAT1/3蛋白表達與PCNA表達成正相關(guān),(r=0.413,P=0.045;r=0.427,P=0.023);高劑量治療4周時,p-STAT1/3蛋白表達與PCNA表達無相關(guān)性,(r=0.252,P=0.179,r=0.313,P=0.116)。

3 討論

CIA大鼠是目前研究RA發(fā)病機制運用較多的動物模型。本實驗采用Wistar大鼠,通過牛Ⅱ型膠原聯(lián)合弗氏完全佐劑誘發(fā)免疫反應,成功誘導了CIA動物模型,造模成功率在70%以上?；诎籽『湍[瘤性疾病的研究成果,近年來,部分風濕病學者以As2O3治療實驗性關(guān)節(jié)炎[6,7],結(jié)果顯示As2O3可以通過抑制滑膜細胞分化,誘導滑膜細胞凋亡,但As2O3的作用機制尚不清楚。

本實驗首先應用免疫組織化學和流式細胞術(shù)兩種方法,從定位和半定量的角度探討了反映細胞增殖的標記物——增殖細胞核抗原(PCNA)的表達情況,模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面、軟骨下骨組織內(nèi)均可見大量PCNA蛋白表達陽性的滑膜細胞浸潤,同時炎細胞增生也顯著增加,提示模型組大鼠滑膜組織已經(jīng)出現(xiàn)高度侵蝕性增生。As2O3治療后,PCNA蛋白在浸潤的炎細胞、滑膜細胞中的表達均下降,說明As2O3能夠顯著抑制包括滑膜細胞在內(nèi)的多種細胞的增殖。

STAT是一種能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的胞質(zhì)蛋白家族,在人和哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)7個STAT家族成員 :STAT 1 ～4 、STAT 5a、STAT 5b、STAT 6,能夠介導多種細胞因子調(diào)控的細胞生長、分化、增殖及凋亡過程[8]。STATs作為轉(zhuǎn)錄因子在沒有特異性的刺激時定位于胞質(zhì)內(nèi),當細胞受到刺激時,STATs上的SH2結(jié)構(gòu)域與細胞膜受體中被磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合,同時自身發(fā)生磷酸化并迅速形成同源或異源二聚體,轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi),與啟動子結(jié)合,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,完成細胞因子受體介導的信號轉(zhuǎn)導,調(diào)節(jié)機體的天然免疫及獲得性免疫應答反應。目前已知,STAT1和STAT3與RA滑膜炎嚴重程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示,模型組關(guān)節(jié)組織中p-STAT1/3表達顯著增高,低劑量As2O3治療4周,p-STAT1/3蛋白表達較模型組明顯下降,并與PCNA表達呈正相關(guān),而高劑量組其表達量有增加趨勢,說明低劑量具有抑制滑膜細胞增殖的作用,而高劑量可能具有促進增殖的作用。既往研究也顯示,4.0 mg/kg/d和6.0 mg/kg/d的As2O3治療CIA大鼠兩周,電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)A型滑膜細胞減少,B型滑膜細胞增加[9]。因此,As2O3治療劑量和療程的選擇尚需進一步探討。

細胞因子信號傳導抑制蛋白(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族是一類由細胞因子誘導產(chǎn)生并反饋性阻斷細胞因子信號轉(zhuǎn)導過程的負性調(diào)節(jié)因子,參與多種細胞因子、生長因子和激素的信號調(diào)節(jié),對于維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)作用[10,11]。SOCS通過與STAT競爭性結(jié)合細胞因子受體的酪氨酸磷酸化位點,對Janus激酶/STAT信號通路進行負反饋調(diào)節(jié),減少多種細胞因子受體的表達而抑制細胞因子介導的信號傳遞。SOCS1是最早被發(fā)現(xiàn)的SOCS家族成員之一,SOCS1是STAT1的特異性內(nèi)源性抑制劑。本研究發(fā)現(xiàn),模型組p-STAT1的活性增強反饋性引起SOCS1表達增強,低劑量As2O3干預治療后,p-STAT1表達減少,其反饋性調(diào)節(jié)作用減弱,SOCS1表達量相對減少;但是當高劑量治療時,隨著p-STAT1表達增加,再次激發(fā)SOCS1表達增加,推測低劑量As2O3可能通過干預p-STAT1/SOCS1信號通路抑制滑膜組織的增殖。SOCS3是STAT3的負性調(diào)節(jié)子。本實驗中,模型組p-STAT3的活性增強也反饋性引起了SOCS3表達增強,低劑量As2O3干預治療后,隨著p-STAT3表達減少,SOCS3表達量也相對減少,但尚無統(tǒng)計學意義。由此看來,As2O3是否對p-STAT3/SOCS3信號通路有顯著抑制作用尚需擴大樣本量進一步研究。

綜上所述,As2O3是抑制滑膜細胞增殖的良好藥物,該藥可通過調(diào)控p-STAT1信號通路抑制關(guān)節(jié)炎進展。但是,As2O3畢竟是一種劇毒物質(zhì),具有治癌和致癌雙向作用。RA發(fā)病機制非常復雜,有多種細胞共同參與滑膜組織的增殖過程,As2O3在低劑量時具有抑制增殖的作用,高劑量可能具有促進細胞轉(zhuǎn)化和原漿毒作用[12],因此,治療時間和劑量的積累對于產(chǎn)生毒副作用都至關(guān)重要。如何在保證療效的前提下,最大限度的降低毒副作用尚需深入探討。是否可以通過改變給藥方式,減輕體內(nèi)蓄積產(chǎn)生的毒副作用,亦有待進一步研究。

1 張 鵬,王樹葉,胡龍虎 et al.三氧化二砷治療急性早幼粒細胞白血病七年總結(jié)—附242例分析[J].中華血液學雜志,2000;21(2):67-70.

2 艾志龍,秦新裕.亞砷酸在實體瘤中的研究進展[J].中國臨床醫(yī)學,2006;13(3):429-430.

3 郭惠芳,劉淑霞,張玉軍 et al.三氧化二砷對高遷移率族蛋白誘導的大鼠滑膜細胞增殖的抑制作用[J].吉大學報醫(yī)學版,2008;34(1):108-111.

4 韓曉楓,馬寶驪,張繼英 et al.雞II型膠原誘導大鼠類風關(guān)模型的建立[J].上海免疫學雜志,2002;21(6):330-333.

5 Larsson P,Kleinau S,Holmdahl R.Homologous typeⅡcollagen-induced arthritis in rats.Characterization of the disease and demonstration of clinically distinct formsof arthritisin two strains of ratsafter immunization with the same collagen preparation[J].Arthritis Rheum,1990;33(5):693-701.

6 韓 鋒,齊文成,任 潔 et al.三氧化二砷對類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞凋亡的影響[J].新醫(yī)學,2009;40(2):80-82.

7 Lemarie A,Morzadec D,Merino O et al.Arsenic trioxide induces apoptosisof human monocytes duringmacrophagic differentiation through nuclear factor-κB-related survival pathway downregulation[J].J Pharmacol Exp Ther,2006;316(2):304-314.

8 Arbouzova N I,Zeidler M P.JAK/STAT signalling in Drosophila:insights into conserved regulatory and cellular functions[J].Development,2006;133(14):2605-2616.

9 張志毅,劉殿新,王 輝 et al.三氧化二砷對膠原誘導的關(guān)節(jié)炎大鼠凋亡及腫瘤壞死因子-α白細胞介素-1的作用[J].中華風濕病學雜志,2005;9(11):650-652.

10 Oshimura A,Nishinakamura H,Matsumura Y et al.Negative regulation of cytokine signaling and immune responsesby SOCSproteins[J].Arthritis Res Ther,2005;7(3):100-110.

11 Yoshimura A,Naka T,Kubo M.SOCS proteins,cytokine signalling and immune regulation[J].Nat Rev Immunol,2007;7(6):454-465.

12 杜金榮,劉家仁,吳永輝et al.砷酸鈉與亞砷酸鈉致NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化的比較研究[J].中國工業(yè)醫(yī)學雜志,1999;12(1):10-12.