胡玲玲 陳昌友 張益紅 郭靜雅 陸海波 旬神美 邱玉華

(南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科,南京210011)

CD28分子是表達在T細胞表面的重要共刺激分子,是由兩條44 kD多肽鏈以二硫鍵連接而成的同源二聚體,為Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)成員。CD28分子與B7-1或B7-2結合可為T細胞活化和增殖提供共刺激信號,從而引發(fā)免疫應答[1]。鼠抗人CD28單克隆抗體2F5與T細胞表面CD28分子交聯(lián)形成多聚化后,產生類似于天然配基B7分子的作用,可促進T細胞活化、增殖與分化,從而介導免疫效應[2]。近年來,利用抗CD28單抗單獨或聯(lián)合抗CD3單抗或細胞因子IL-2等擴增腫瘤特異性T細胞(CTL)的研究正日益深入[3-5]。腫瘤患者外周血單個核細胞(PBMC)與抗CD28單抗共培養(yǎng)后,Foxp3+Treg的比例下調,提示該抗體能夠使腫瘤患者的免疫功能得到一定程度的恢復與提高[6]。研究表明,抗CD28特異性單鏈抗體可活化腫瘤特異性T細胞,進而抑制腫瘤細胞的增長[7]。本研究在已成功研制了鼠抗人CD28單克隆抗體的基礎上,觀察2F5對人惡性T淋巴瘤細胞株Jurkat體外增殖的抑制效果;建立裸鼠T淋巴細胞瘤動物模型,探討其對T淋巴瘤的體內抗腫瘤效應。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑、儀器、細胞株及動物 鼠抗人CD28抗體2F5由本室研制并保存;PE標記的羊抗鼠IgG(Fc;BD,美國);MTT(Sigma,美國);RPMI1640 基礎培養(yǎng)基(Gibco,美國);CO2培養(yǎng)箱、離心機(Jouan,法國);倒置顯微鏡 (Olympus,日本);流式細胞儀(Beckman-Coulter,美國);550型酶標儀(Bio-rad,美國);人惡性 T淋巴瘤細胞株 Jurkat購自ATCC;BALB/c裸鼠(上海斯耐克動物中心,中國)。

1.2 鼠抗人CD28單抗 2F5對 Jurkat細胞膜型CD28分子的識別 收集生長良好的Jurkat細胞,用含1%BSA的PBS洗滌1次,調整細胞濃度至5×106ml-1,取100μl細胞懸液加到流式試管中,加入20μl 50mg/ml的鼠抗人CD28抗體混勻,4℃孵育40分鐘。PBS充分洗滌,加入PE標記的羊抗鼠IgG二抗,4℃孵育40分鐘,用含1%BSA的PBS洗滌2次,將細胞重懸于300μl PBS溶液中,流式細胞儀分析。采用小鼠同型IgG抗體做對照。

1.3 CD28單抗對Jurkat細胞體外增殖的抑制作用

收集生長狀態(tài)良好的Jurkat細胞,調整細胞濃度至2.0×106ml-1,100μl/孔加至96孔板。加入100 μl抗 CD28單抗(終濃度為 5 μg/ml),37℃、5%CO2分別培養(yǎng)24、48、72及96小時后,每孔加入20μl濃度為5 g/L的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4小時,離心棄上清后再加入100μl DMSO,震蕩混勻10分鐘,570 nm測定吸光度值。每組設置3個復孔,同時設置抗體同型對照和空白對照。抑制率=(同型對照組A值-實驗組A值)/同型對照組A值×100%。

1.4 Jurkat細胞荷瘤裸鼠模型的建立 取6周齡、雌性、體重為20～25克的BALB/c裸鼠41只。隨機選取35只接種1×107的Jurkat細胞于裸鼠左前肢腋下,接種當天為第1天,逐日觀察并記錄腫瘤形成時間、成瘤率、腫瘤大小及裸鼠生存狀態(tài)等指標。當可以檢測到腫瘤時,用游標卡尺測量腫瘤大小。腫瘤生長速度以成瘤潛伏期、荷瘤小鼠存活期和腫瘤結節(jié)大小來衡量。腫瘤結節(jié)體積:υ(mm3)≈(4/3π×長徑×短徑×高度)×1/8。剩余6 只未作任何處理,作為陰性對照,觀察裸鼠的生存狀態(tài)。

1.5 CD28單抗對Jurkat細胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用

在無菌條件下,將抗CD28單抗稀釋到1μg/μl。選取16只荷瘤裸鼠隨機分成兩組,試驗組10只,陰性對照組6只,試驗組做剪耳標記。首先用游標卡尺測量荷瘤的長、寬 、高,荷瘤體積:V=4π/3×長 ×寬×高≈1/2(長×寬×高),然后采用瘤內抗體多點注射方法,每mm3的瘤體注射1μg抗體。用藥后逐日觀察,每間隔7天測量裸鼠的腫瘤大小,并記錄荷瘤裸鼠生長狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學分析方法 所有統(tǒng)計分析在SAS(Statistical Analysis System,SAS Institute Inc.,Cary,NC)統(tǒng)計軟件中完成。服從正態(tài)分布的數(shù)值變量采用±s描述。在同一標本的重復測量中,采用均數(shù)估計進行點估計,并通過標準差反映儀器誤差的大小。在分析抗CD28抗體對瘤體生長的影響時,采用多水平模型處理重復測量的數(shù)據(jù),并考察組間效應及時間趨勢。

2 結果

2.1 鼠抗人CD28單克隆抗體2F5對Jurkat細胞膜型CD28分子的識別 流式細胞儀分析結果表明,鼠抗人CD28單克隆抗體2F5可識別Jurkat細胞表面膜型CD28分子,陽型結合率可達93.37%,見圖1。

2.2 抗CD28單抗體對Jakurt細胞體外增殖的抑制作用 抗CD28單抗與Jurkat細胞共培養(yǎng)后,顯微鏡下觀察,48小時可見細胞有增殖現(xiàn)象,培養(yǎng)至96小時可見細胞胞質中出現(xiàn)黑色顆粒,細胞膜不完整或出現(xiàn)破裂,細胞的折光性和立體感減弱,呈現(xiàn)凋亡狀態(tài);而不加抗體組和同型對照組Jurkat細胞沒有出現(xiàn)凋亡狀態(tài)(圖2)。MTT法分析結果顯示,與同型對照組相比,抗CD28單抗對Jurkat細胞的增殖具有明顯的抑制作用(圖3)。

2.3 Jurkat細胞荷瘤裸鼠的成瘤率及荷瘤情況 裸鼠接種第30天時,有24只長出清晰可見的腫瘤,成瘤率可達到70%。裸鼠在腫瘤成長期生長良好,健康,活躍。圖4為荷瘤裸鼠。

圖1 抗CD28單抗對Jurkat細胞表面CD28分子的識別Fig.1 Recognition of CD28 Mab with surface molecule CD28 on Jurkat cell

圖2 Jurkat細胞與小鼠2F5、小鼠IgG共培養(yǎng)以及空白對照組圖(×400)Fig.2 Jurkat cells cultured with 2F5,mouse IgG,and blank control(×400)

圖3 2F5對Jurkat細胞體外增殖的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of 2F5 on proliferation of Jurkat cell in vitro

圖4 Jurkat細胞荷瘤裸鼠Fig.4 Naked mousebearing Jurkat tumor

表1 各時間點的組間腫瘤大小變化比較Tab.1 Comparison of change on tumor sizes between groups at each time-point

2.4 鼠抗人CD28單抗對Jurkat細胞荷瘤裸鼠的治療作用 CD28單抗經瘤內多點注射荷瘤裸鼠后,通過逐日觀察荷瘤裸鼠腫瘤的生長狀況,發(fā)現(xiàn)用藥組荷瘤裸鼠腫瘤直至第35天都沒有出現(xiàn)明顯的增殖現(xiàn)象,而同型對照組和陰性組卻出現(xiàn)了明顯的增殖狀況。采用多水平模型分析腫瘤大小的組間差異結果顯示,組間基線腫瘤大小差異有統(tǒng)計學意義(z=19.89,P=0.000 0),調整基線腫瘤大小后,組間差異仍然有統(tǒng)計學意義(z=4.89,P=0.000 0)。對照組自第21天起腫瘤明顯增大,而試驗組自第14天起明顯下降。對各時間點的腫瘤體積下降值進行組間比較,采用Bonferroni法調整檢驗效能的結果顯示,自21天起,組間差異有統(tǒng)計學意義(P值皆為0.000 0)。見表1。

3 討論

T細胞瘤表面高表達CD28分子,本研究在自主研制了抗CD28激發(fā)性單抗2F5的基礎上,探討單抗2F5與T淋巴瘤表面的CD28分子結合后,對T細胞瘤增殖的抑制作用。把T淋巴瘤細胞株Jurkat與單抗2F5共培養(yǎng)48小時可見細胞有增殖現(xiàn)象,培養(yǎng)至96小時,顯微鏡下可見胞質中出現(xiàn)黑色顆粒,胞膜破裂,細胞的折光性和立體感減弱。表明Jurkat細胞在與單抗2F5共培養(yǎng)的初期,可能由于單抗對細胞的激發(fā)作用,促進細胞的增殖,但隨著培養(yǎng)時間的延長,對Jurkat細胞增殖具有明顯的抑制作用。

將Jurkat細胞接種于裸鼠腋下,建立Jurkat細胞荷瘤裸鼠模型。共接種35只裸鼠,其中24只長出清晰可見的腫瘤,成瘤率可達到70%。部分裸鼠未成瘤的原因可能為腫瘤細胞注射完成時細胞在針眼口溢出,致使注射的細胞數(shù)目減少而沒有生長腫瘤,還有一個原因可能為裸鼠具有一定的免疫能力。裸鼠在腫瘤成長期生長良好、健康、活躍。裸鼠長出了較大的腫瘤后,挑選10只經瘤內多點注射抗體,逐日觀察腫瘤的大小和裸鼠的生存狀態(tài),并每間隔7天進行記錄。選取6只裸鼠注射生理鹽水作為陰性對照。經抗體注射后的裸鼠,與對照組相比,腫瘤并未出現(xiàn)明顯的大小變化,因此認為,裸鼠瘤內局部注射單抗2F5,抑制了腫瘤的生長。另外,在剛剛注射抗體后對腫瘤有一定刺激作用,腫瘤略增大,隨后腫瘤則被抗體抑制出現(xiàn)減小。這與體外實驗結果相一致。而對照組老鼠腫瘤則出現(xiàn)較為明顯的增長。我們推測,荷瘤裸鼠經CD28單抗2F5注射后,由于抗體對腫瘤細胞的抑制作用,因此腫瘤未出現(xiàn)明顯的增長。另假設荷瘤小鼠無免疫缺陷,由于單抗2F5可促進T細胞活化、增殖與分化,從而激發(fā)機體對腫瘤的免疫應答,對腫瘤的生長應具有進一步的抑制作用。國外也有報道,通過使用干擾素刺激機體對T細胞瘤進行免疫應答,從而治療皮膚T細胞淋巴瘤的案例[8]。

綜上所述,我們認為鼠抗人CD28單克隆抗體2F5對Jurkat細胞的體內外增殖具有明顯的抑制作用,可作為治療T細胞淋巴瘤的一個潛在新型生物藥物,為抗體介導的腫瘤靶向治療提供新的方法和思路。我們將對抗CD28單克隆抗體2F5抑制T細胞淋巴瘤增殖的機制進行研究,為抗CD28單克隆抗體2F5進一步的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 Andaloussi A,Lesniak M S.CD4+CD25+Foxp3+T-cell infiltration and home oxygenase-1 expression correlate with tumor grade in human gliomas[J].J Neurooncol,2007;83(2):145-152.

2 邱玉華,於葛華,陳永井 et al.激發(fā)型CD28單抗直接激發(fā)的細胞及其表型[J].上海免疫學雜志,2003;23(5):324-326.

3 Michael T,Gabriele H,ThomasH et al.CD28-induction of proliferation in resting T cells in vitro and vivowithout engagement of the T cell receptor:evidence for function distinct forms of CD28[J].Eur J Immunol,1997;27(1):239-247.

4 Chang A E,Aruga A,Cameron M J et al.Adoptive immunotherapy with vaccine-primed lymph node cells secondarily activation with anti-CD3 and interleukin-2[J].JClin Oncol,1997;15(2):796-807.

5 Li Q,Fueman SA,Bradford C R et al.Expanded tumor-reactive CD4+T cell responses to human cancers induced by secondarary anti-CD3/anti-CD28 activation[J].Clin Cancer Res,1999;5(2):461-469.

6 杜陽陽,沈麗琴,王艷茹 et al.激發(fā)性CD28單抗對腫瘤患者外周血FOXP3+Treg細胞的下調作用及意義[J].實用腫瘤學雜志,2009;23(2):113-117.

7 Otz T,Groe-Hovest L,Hofmann M et al.A bispecific single-chain antibody that mediates target cell-restricted,supra-agonistic CD28 stimulation and killing of lymphoma cell[J].Leukemia,2009;23(1):71-77.

8 Lansigan F,Foss F M.Current and emerging treatment strategies for cutaneous t-cell lymphoma[J].Drugs,2010;70(3):273-286.