劉曉東 成珍 趙潔 趙富責 易卿 胡書才

1.河南省農業(yè)微生物工程技術研究中心，河南三門峽 472143；2.三門峽龍飛生物工程有限公司，河南三門峽 472143

河南省農業(yè)微生物工程技術研究中心聯(lián)合三門峽龍飛生物工程有限公司研制的益生菌飼料添加劑是根據動物學原理，篩選出安全性高、抗病性好、產酶量大的芽孢桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌、酵母菌等有益菌群經特殊工藝復合而成。其中，芽孢桿菌、酵母菌可產生大量的消化酶，能夠促進畜禽腸胃消化和吸收、增加食欲、促進排便，并能提高飼料利用率和畜禽生產能力，增加養(yǎng)殖戶的經濟收入；乳酸菌產生的有機酸，可以抑制多種革蘭氏陰性病原菌的繁殖，使畜禽糞便和血液中的氨含量降低，明顯緩解圈舍的氨味和臭味，改善養(yǎng)殖環(huán)境。大量有益菌進入畜禽腸道后，增加了腸道內的有益菌量，有效抑制了病原菌的繁殖，增強了畜禽的抗病能力；同時，還可以合成大量的氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質。

1 材料與方法

1.1 菌 種

枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、乳酸乳桿菌及兩歧雙歧桿菌均由河南省農業(yè)微生物工程技術研究中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

1）乳酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌培養(yǎng)基。MRS固體培養(yǎng)基：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，吐溫80 1mL，無水乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，檸檬氫二銨2g，水合硫酸鎂580mg，水合硫酸錳280mg，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL，調pH值6.5、121℃高壓滅菌20min。MRS液體培養(yǎng)基：配方同上，不加瓊脂。

2）枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL，調pH 值7.0～7.2、121℃高壓滅菌20min。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：配方同上，不加瓊脂。

3）產朊假絲酵母培養(yǎng)基。麥芽汁固體培養(yǎng)基：麥芽汁1 000mL，瓊脂20g，pH 值自然（約6.4）、121℃高壓滅菌20min。麥芽汁液體培養(yǎng)基：配方同上，不加瓊脂。

1.3 菌種篩選活化及懸浮液制備

1）乳酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌篩選活化及懸浮液制備。將河南省農業(yè)微生物工程技術研究中心保藏的乳酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌分別接種于牛奶溶液中，37℃厭氧培養(yǎng)72h，牛奶凝固。取0.1mL凝乳加入9.9mL無菌水進行稀釋，制得乳酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌懸液。將菌懸液在MRS固體培養(yǎng)基上進行平板劃線分離后，37℃厭氧培養(yǎng)72h，對平板中的菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察，選出合適的菌轉接備用。

從篩選出的優(yōu)良菌種的固體培養(yǎng)基平皿上挑取菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)72h；以接種環(huán)蘸取1環(huán)菌液，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線接種，37℃厭氧培養(yǎng)72h。依此連續(xù)傳接3代，測其活菌數；用無菌移液管取最后1代細胞培養(yǎng)液1mL進行梯度稀釋，至合適的稀釋度；再取0.1 mL稀釋液，采用平板計數法進行菌落計數；取活菌濃度達108cfu／mL的相應稀釋菌懸液，置于冰箱，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）枯草芽孢桿菌和產朊假絲酵母的篩選活菌及菌懸浮液制備。分別將枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母菌種制成菌懸浮液，對菌懸浮液進行平板劃線分離，置37℃培養(yǎng)24h（枯草芽孢桿菌）和28℃培養(yǎng)72h（產朊假絲酵母），經鏡檢，挑選出合適的菌株轉接備用。分別從篩選出的優(yōu)良菌的固體培養(yǎng)皿上挑取菌落，接種于枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母的液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24h（枯草芽孢桿菌）和28℃培養(yǎng)72h（產朊假絲酵母）；依此連續(xù)傳接3代，梯度稀釋，采用平板計數法進行菌落計數；取活菌濃度達108cfu／mL的相應稀釋菌懸液，置于冰箱，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 種子液制備

1）乳酸乳桿菌種子液制備。分別將乳酸乳桿菌及兩歧雙歧桿菌混合懸浮液按2%的接種量，接種于裝有100mL MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃厭氧培養(yǎng)72h，待活菌濃度達到108cfu／mL，即可作為乳酸乳桿菌及兩歧雙歧桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化的種子液。

2）枯草芽孢桿菌種子液的制備。將枯草芽孢桿菌懸浮液以2%的接種量，接種于裝有100mL牛肉膏液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)24h，待活菌濃度達到108cfu／mL，即可作為枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝優(yōu)化的種子液。

3）產朊假絲酵母種子液的制備。將產朊假絲酵母懸浮液以2%的接種量，接種于裝有100mL麥芽汁液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃培養(yǎng)72h，待活菌濃度達到108cfu／mL，即可作為產朊假絲酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化的種子液。

1.5 工藝流程

1.6 菌種一級擴培

將麥麩、米糠粉碎后，按9∶1比例加水混合，蒸汽滅菌，冷卻后水分約30%～35%，基礎蛋白含量16%左右。然后分別將枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、產朊假絲酵母種子液按1%的接種量接種在固體物料上。酵母菌溫度控制在25～30℃，培養(yǎng)24h；芽孢桿菌溫度控制在40～50℃，培養(yǎng)48h；乳酸菌溫度控制在37℃左右，厭氧培養(yǎng)72h。最后經低溫干燥后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 復合益生菌飼料添加劑發(fā)酵

將麥麩、豆粕、米糠粉碎后，按8.5∶0.5∶1.0比例加水混合均勻，使物料水分達到30%～35%，基礎蛋白含量16%左右。然后將酵母菌、芽孢桿菌、乳酸菌的一級擴培菌種按2%接種量接入固態(tài)物料中，混合均勻，分別進行發(fā)酵。發(fā)酵溫度及培養(yǎng)時間同上，發(fā)酵過程溫度變化情況如圖1所示。

圖1 發(fā)酵過程溫度變化

1.8 復合益生菌飼料添加劑烘干及混合

將發(fā)酵好的物料進行低溫烘干（溫度≤50℃），然后根據飼喂對象對微生物的需求進行混合配比，經抽樣檢測合格后包裝、入庫。

1.9 飼喂操作

選擇新美系40日齡的仔豬100頭，按照體重相近原則，隨機分為試驗組和對照組，每組各設5個重復，每個重復設置10頭豬，試驗組飼喂基礎日糧＋2%益生菌飼料添加劑，對照組飼喂基礎日糧。先經過5d換料期，使豬適應此飼料，再進行為期100d的對比試驗。采用方差分析的方法進行差異分析。

2 結果與分析

2.1 感官檢測

發(fā)酵前，手握物料成團，無明顯水樣，顏色為原料的本來色澤，無其他氣味。發(fā)酵中期，酵母菌有酵母香味（發(fā)酵24h后），顏色較深；芽孢桿菌有特殊的腥味（發(fā)酵48h后），手捏物料有滑感，而且肉眼可看到菌絲；乳酸菌稍有酒香味和酸甜味（發(fā)酵72h后），顏色變黃。發(fā)酵后期，酵母菌酵母香味更濃，色澤暗黃，手握成團，松開呈蓬散狀；芽孢桿菌的特殊腥味更濃，菌絲很多，色澤暗黃，手握成團，松開呈蓬散狀；乳酸菌帶有濃郁的酒香味和酸甜味，色澤金黃，手握成團，松開呈蓬散狀。

2.2 常規(guī)分析

對發(fā)酵后的益生菌飼料添加劑進行常規(guī)分析，結果見表1。

表1 復合益生菌飼料添加劑部分成分分析 %

2.3 活菌數測定

益生菌飼料添加劑活菌數測定采用的是平板培養(yǎng)計數法測定樣品中的活菌數量。產朊假絲酵母用馬丁培養(yǎng)基測定，活菌數為4.50×109個／g以上；枯草芽孢桿菌用牛肉膏培養(yǎng)基測定，活菌數為6.50×109個／g以上；乳酸乳桿菌用 MRS培養(yǎng)基在厭氧箱培養(yǎng)測定，活菌數為3.50×108個／g以上；兩歧雙歧桿菌用MRS培養(yǎng)基在厭氧箱培養(yǎng)測定，活菌數為1.68×108個／g以上。

2.4 pH值測定

益生菌飼料添加劑成品pH值檢測結果為6.89，接近中性，適用于多種畜禽。

2.5 酶活測定

益生菌飼料添加劑成品酶活測定結果為：淀粉酶活力≥312U／g；蛋白酶活力≥550U／g；纖維酶活力≥518U／g。

2.6 豬只生長狀況及經濟效益分析

益生菌飼料添加劑對豬的生長影響見表2、3，經濟效益分析見表4。

表2 試驗期觀察

表3 益生菌飼料添加劑對育肥豬生長性能的影響

表4 經濟效益分析

由表2常規(guī)觀察可見，試驗期試驗組的豬只食欲旺盛、膚色發(fā)紅、體格健壯、生長整齊、臂大腰圓且沒有出現腹瀉病例，對照組的豬只食欲一般、生長不齊，且有12%的豬發(fā)病。由表3計算可知，試驗期試驗組豬只平均日增重比對照組提高了8.89%，料肉比降低了6.18%，平均日采食量提高了2.27%，差異顯著（P＜0.05）。由表4可知，試驗組平均每頭豬凈利潤比對照組提高了9.24%，即平均每頭豬增加了57.10元收入，經濟效益顯著（P＜0.05）。這說明益生菌飼料添加劑在促進畜禽生長、提高飼料利用率、抗病、增加養(yǎng)殖收入等方面效果顯著。

3 討 論

1）通過特殊工藝技術制得的益生菌飼料添加劑含有大量有益菌（其中產朊假絲酵母4.50×109個／g以上、枯草芽孢桿菌6.60×109個／g以上、乳酸乳桿菌3.50×108個／g以上、兩岐雙歧桿菌1.68×108個／g以上），這些有益菌群在發(fā)酵的過程中產生了大量酶，能夠促進畜禽腸胃消化和吸收、增加食欲、促進排便，改善飼料的利用效率，提高畜禽生產能力，增加養(yǎng)殖戶的經濟收入。

2）在飼喂過程中，大量有益菌進入畜禽腸道后，提高了腸道內有益菌的含量，改善了畜禽腸道微生態(tài)環(huán)境，能有效抑制病原菌的繁殖，使有益菌占優(yōu)勢地位，從而增強畜禽機體免疫力，起到防病、抗病作用。

3）試驗中的復合益生菌飼料添加劑的作用原理還需進一步深入研究。