彭 文，劉兆雄

(四川省德陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，四川 德陽(yáng) 618000)

四季三黃片是由大黃、黃芩、梔子、黃柏加工而成的中藥成方制劑，功能消炎退熱、通便利水，用于治療口鼻生瘡、咽疼牙痛、口干舌燥、目眩頭暈、大便秘結(jié)、小便赤黃[1]。方中黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血活血、安胎的功效，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)黃芩根提取物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化以及清除氧自由基、治療心血管疾病等作用[2];黃柏具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，用于治療濕熱瀉痢、黃疸帶下、熱淋、腳氣、瘺、骨蒸勞熱、盜汗遺精、瘡瘍腫毒、濕疹瘙癢[3]。黃芩苷和鹽酸小檗堿分別為黃芩和黃柏中的活性物質(zhì)，現(xiàn)行藥品標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)方中大黃的有效成分大黃酸和大黃酚進(jìn)行定量分析[1]，且現(xiàn)有文獻(xiàn)均分別對(duì)大黃酸和大黃酚、黃芩苷、梔子苷進(jìn)行含量測(cè)定[4－7]。筆者采用反相高效液相色譜、梯度洗脫方法同時(shí)對(duì)四季三黃片中的黃芩苷和鹽酸小檗堿進(jìn)行了含量測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀，包括2487紫外檢測(cè)器、Empower色譜工作站;美國(guó)Varian Cary 100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。黃芩苷、鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110715－200815和110713－200609);四季三黃片(江西華太藥業(yè)有限公司，批號(hào)為090623，090630，090712);陰性對(duì)照藥材(德陽(yáng)大中藥業(yè)公司)，質(zhì)量符合2005年版《中國(guó)藥典(一部)》規(guī)定;乙腈(上海陸都化學(xué)試劑廠)為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:A 為 2% 的三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié) pH=3.0)，B為乙腈，梯度洗脫(表1);柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):263 nm;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:10 μL。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度表

2.2 溶液制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品0.1123 g和鹽酸小檗堿對(duì)照品0.09921 g，分別置100 mL量瓶中，加70%乙醇適量使溶解后，加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液Ⅰ和對(duì)照品貯備液Ⅱ。取樣品適量，研細(xì)，精密稱取0.3015 g，置具塞錐形瓶中，加70%的乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，50℃超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加70%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取除黃芩外的其他處方量藥材，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制備方法制成陰性對(duì)照樣品，取0.2836 g，按供試品溶液制備方法操作，即得陰性對(duì)照品溶液Ⅰ;另取除黃柏外的其他處方量藥材，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制備方法制成陰性對(duì)照樣品，取0.2879 g，按供試品溶液制備方法操作，即得陰性對(duì)照品溶液Ⅱ。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):精密量取兩種對(duì)照品貯備液5 mL，置50 mL量瓶中，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液Ⅰ、陰性對(duì)照品溶液Ⅱ，照上述色譜條件分別進(jìn)樣。色譜圖見(jiàn)圖1。供試品溶液色譜中，有與對(duì)照品溶液色譜中黃芩苷和鹽酸小檗堿相對(duì)應(yīng)的色譜峰，且2個(gè)色譜峰之間的分離度及與其他色譜峰的分離度均大于1.5;陰性對(duì)照品溶液Ⅰ色譜中則無(wú)黃芩苷的色譜峰，陰性對(duì)照品溶液Ⅱ色譜中則無(wú)鹽酸小檗堿的色譜峰。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密量取對(duì)照品貯備液Ⅰ和對(duì)照品貯備液Ⅱ各 0.5，5.0，10.0，15.0，20 mL，分別置 5 個(gè) 50 mL 量瓶中，加 70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，照上述色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量(μg)對(duì)色譜峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，黃芩苷為 A=1964615 C －113.5，r=0.9998(n=5)，鹽酸小檗堿為 A=3757220 C －1041.5，r=0.9999(n=5)。結(jié)果表明，黃芩苷和鹽酸小檗堿進(jìn)樣量分別在 0.1123 ～2.2460 μg和 0.0992 ～1.984 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密量取對(duì)照品貯備液Ⅰ和對(duì)照品貯備液Ⅱ各5 mL，置50 mL量瓶中，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液照上述色譜條件進(jìn)樣5次。結(jié)果黃芩苷和鹽酸小檗堿平均峰面積分別為2206383和3727162，RSD分別為0.5%和0.6%(n=5)。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一批樣品(批號(hào)為090623)6份，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果黃芩苷和鹽酸小檗堿色譜峰平均峰面積(折算為稱樣量0.3 g時(shí)的峰面積)為2444133和2018843，RSD分別為 0.7% 和 0.9%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于0，2，6，12 h時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果3組樣品中黃芩苷和鹽酸小檗堿在各時(shí)間點(diǎn)的色譜峰峰面積的 RSD 值分別為 0.7% ，0.6% ，1.2% 和 0.3% ，1.1% ，1.0% ，表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定，能滿足含量測(cè)定要求。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品(批號(hào)為090623，標(biāo)示質(zhì)量為 0.3 g，每片含黃芩苷 6.6310 mg、鹽酸小檗堿 2.6852 mg)6 份，每份約0.3 g，精密稱定，研細(xì)，置6個(gè)具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品貯備液Ⅰ和對(duì)照品貯備液Ⅱ1，1，5，5，10，10 mL，加 70%的乙醇100 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品10片，研細(xì)，精密稱取適量(約0.3 g)，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果樣品批號(hào)為 090623，090630，090712的樣品中黃芩苷和鹽酸小檗堿含量分別為6.6310 mg/片和2.6852 mg/片，6.8251 mg/片和 2.6533 mg/片，6.9003 mg/片和 2.7013 mg/片(n=3)。

3 討論

精密量取對(duì)照品貯備液Ⅰ和對(duì)照品貯備液Ⅱ各1 mL，分別置2個(gè)100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻，濾過(guò)，分別取續(xù)濾液，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果黃芩苷對(duì)照品溶液在263 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液在263 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且最大吸收波長(zhǎng)處曲線平滑，故選擇263 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

試驗(yàn)中流動(dòng)相采用梯度洗脫，是為了讓各成分分離效果在較短的保留時(shí)間內(nèi)達(dá)到藥典規(guī)定，以避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)降低檢測(cè)靈敏度。

[1]YBZ05432006，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]吳冬莉，李 青，邱東平.淺談中藥黃芩的藥理作用[J].中華中西醫(yī)學(xué)雜志，2010(5):125－126.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:211.

[4]馮 看，楊 黎.HPLC測(cè)定四季三黃片中大黃素和大黃酚的含量[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，11(2):56－58.

[5]許江紅，張若良.HPLC法測(cè)定四季三黃片中黃芩苷的含量[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18(6):13.

[6]黃叔章.RP－HPLC法測(cè)定四季三黃片中梔子苷的含量 [J].廣西中醫(yī)藥，2004，27(4):53 －54.

[7]卞艷晶，高延甲，王 建.四季三黃片質(zhì)量控制方法的研究[J].齊魯藥事，2010(1):24－26.