孫 靜，邵淑麗

1.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西省腫瘤醫(yī)院婦科，山西 太原 030013

卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于其早期癥狀不典型且較隱匿，較早就可發(fā)生轉(zhuǎn)移和廣泛播散，且目前仍缺乏早期有效的診斷技術(shù)，患者就診時(shí)75%～85%皆已屬臨床晚期[1]，因而死亡率極高。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激 活 因 子3（signal transducer and activater of transcription，STAT3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[2]，特別是在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移及免疫逃逸方面的作用尤為重要[3-4]。正常的卵巢細(xì)胞里無(wú)STAT3活化，而在多種卵巢癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)STAT3呈過(guò)度激活表達(dá)，本研究利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建siRNA（Small interference RNA）-STAT3來(lái)沉默STAT3癌基因的表達(dá)，從而了解STAT3對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外侵襲與轉(zhuǎn)移影響，為卵巢癌的基因治療探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

pSilencer2.1-U6-neo質(zhì)粒購(gòu)自Ambion公司，各種酶為大連Takara生物公司產(chǎn)品，STAT3單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞和人正常卵巢細(xì)胞均采用含10%FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于5%CO2的37℃溫箱中，每隔2 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞養(yǎng)至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 STAT3、siRNA轉(zhuǎn)錄模板的設(shè)計(jì)及合成[5]從GenBank中查找人STAT3基因的全長(zhǎng)序列，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)STAT3特異寡核苷酸序列，在設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列兩端分別引入兩個(gè)酶切位點(diǎn)，加入9個(gè)堿基對(duì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3′末端加有轉(zhuǎn)錄終止序列TTTTT，以形成發(fā)夾狀siRNA寡核苷酸鏈序列 ：STAT3 正 義 鏈 5′-GATCCATCCAGAGTCACTGGAAGTT TCAAGAGAAGTTCCAGTGA CTCTGGATTTTTTTGTCGACA-3′， 反義鏈 5′-AGCTTGTCGACAAAAAAATCCAGAGTCCACTGG AAC TTCTCTTGAAAGTTCCAGTGACTCTGGATG-3′。同時(shí)建立無(wú)同源性序列的non-target siRNA為陰性對(duì)照，正義鏈5′-GATCCTTCTCCGAACGTCTCACGTTTCAAGAGAACGTGCACGT TCGGAGAATTTTTTGTCGACA-3′， 反義鏈 5′-AGCTTGTCGA CAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGA CACGTTCGGAGAAG-3′（由上海博亞公司合成）。

1.2.3 siRNA-STAT3表達(dá)載體的構(gòu)建 將合成的引物退火緩沖液作用下退火，與經(jīng)過(guò)BglⅡ、HindⅢ雙酶切的質(zhì)粒pSilencer2.1-U6-neo連接，熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，堿裂解法快速抽提質(zhì)粒。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞和人正常卵巢細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)70%～80%；將LipofectamineTM2000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋?zhuān)缓髮⑾♂尩膕iRNA-STAT3、空質(zhì)粒與稀釋的LipofectamineTM2000，輕輕混合均勻后放于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，吸去無(wú)血清培養(yǎng)液，加入含10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)STAT3蛋白的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分成五組：正常卵巢細(xì)胞對(duì)照組、正常卵巢細(xì)胞siRNA-STAT3組、SKOV3細(xì)胞對(duì)照組、SKOV3細(xì)胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及SKOV3細(xì)胞siRNA-STAT3組。提取各組細(xì)胞總蛋白，定量后用蛋白上樣緩沖液調(diào)整濃度，取25 μg上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，常規(guī)封閉后，加入一抗4℃過(guò)夜，再加入用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記過(guò)的二抗37℃下孵育2 h，ECL顯色。

1.2.6 Transwell侵襲小室及侵襲相關(guān)蛋白MMP-2的檢測(cè)將SKOV3細(xì)胞對(duì)照組、SKOV3細(xì)胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及SKOV3細(xì)胞siRNA-STAT3組細(xì)胞用含1%FBS的培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108個(gè)/L，取稀釋好的Matrigel 25 μl加入Transwell小室底部膜的上室面，覆蓋整個(gè)聚碳酯膜，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，使Matrigel聚合成凝膠，取配制好的細(xì)胞懸液100 μl加入小室上室面，然后將24孔板下室加入600 μl含20%FBS的培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室上室，用PBS洗兩遍，然后用濕棉簽輕輕擦去凝膠和聚碳酯膜上的細(xì)胞，小心取出上室，用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min后，行Giemsa染色。在高倍鏡下（×200）隨機(jī)選取10個(gè)不同視野的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。將三組細(xì)胞蛋白提取出后，按Western blot檢測(cè)STAT3蛋白的表達(dá)的步驟檢測(cè)侵襲相關(guān)蛋白MMP-2的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩樣本均數(shù)比較采用 t檢驗(yàn)，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞STAT3蛋白的表達(dá)

正常卵巢細(xì)胞對(duì)照組、正常卵巢細(xì)胞siRNA-STAT3組、SKOV3細(xì)胞對(duì)照組、SKOV3細(xì)胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和SKOV3細(xì)胞siRNA-STAT3組的STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.33±0.19）、（0.33±0.06）、（0.83±0.14）、（0.82±0.18）、（0.35±0.18）。SKOV3細(xì)胞siRNA-STAT3組STAT3蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖 1。

圖1 siRNA-STAT3對(duì)各組細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)水平的影響

2.2 siRNA-STAT3對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響

與SKOV3細(xì)胞對(duì)照組和SKOV3細(xì)胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，SKOV3細(xì)胞siRNA-STAT3組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。而SKOV3細(xì)胞陰性對(duì)照組和SKOV3細(xì)胞陰性對(duì)照組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差別。見(jiàn)表1。

2.3 siRNA-STAT3對(duì)卵巢癌細(xì)胞中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

SKOV3細(xì)胞siRNA-STAT3組中MMP-2蛋白的表達(dá)水平降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而SKOV3細(xì)胞陰性對(duì)照組與SKOV3細(xì)胞對(duì)照組中MMP-2蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

表1 不同組穿過(guò)基底膜的卵巢癌細(xì)胞數(shù)（）

表1 不同組穿過(guò)基底膜的卵巢癌細(xì)胞數(shù)（）

SKOV3細(xì)胞對(duì)照組SKOV3細(xì)胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SKOV3細(xì)胞siRNA-STAT3組組別 穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)/200倍視野）67.2±5.71 68.9±4.27 32.5±6.10

圖2 siRNA-STAT3對(duì)卵巢癌細(xì)胞中MMP-2表達(dá)水平的影響

表2 不同組中MMP-2的表達(dá)量（）

表2 不同組中MMP-2的表達(dá)量（）

SKOV3細(xì)胞對(duì)照組SKOV3細(xì)胞空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SKOV3細(xì)胞siRNA-STAT3組組別 MMP-2的相對(duì)表達(dá)量0.82±0.18 0.82±0.11 0.35±0.13

3 討論

STAT3是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，是JAKs激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（JAKs-STATs）轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一員，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。STAT3在人體正常組織中很少或沒(méi)有活化，而在乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（SCCHN）、卵巢癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、宮頸癌、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓癌和各種白血病等中存在持續(xù)激活的STAT3蛋白[6]，已被歸為癌基因。Briggs等[7]發(fā)現(xiàn)，STAT3可在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因啟動(dòng)子區(qū)域由結(jié)合位點(diǎn)持續(xù)激活，誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤新生血管形成，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)（MMps）中MMP-2的基因啟動(dòng)子內(nèi)部也存在有STAT3的高親和力結(jié)合位點(diǎn)，STAT3活化后能直接調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)，MMP-2參與對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，促使卵巢癌細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[8]。

RNA干擾（RNAi）是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)、逐漸發(fā)展起來(lái)的一種新興基因阻斷技術(shù)，它是將靶基因所對(duì)應(yīng)的小分子雙鏈RNA（double-stranded RNA， dsRNA）導(dǎo)入有機(jī)體，通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA來(lái)產(chǎn)生特異的基因沉默作用，進(jìn)而阻斷細(xì)胞中特定基因的表達(dá)[9]。Kunigal等人研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默STAT3基因表達(dá)，能夠抑制某些癌細(xì)胞增殖功能和誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建STAT3目的基因的發(fā)夾狀siRNA表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染到卵巢癌SKOV3細(xì)胞中，使siRNA發(fā)揮沉默作用，抑制卵巢癌細(xì)胞中STAT3 mRNA的表達(dá)，阻斷STAT3通路。同時(shí)，利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及對(duì)侵襲相關(guān)蛋白MMP-2表達(dá)水平的檢測(cè)來(lái)判斷其對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲性與轉(zhuǎn)移性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：siRNA-STAT3組中STAT3蛋白表達(dá)水平降低、穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少、侵襲相關(guān)蛋白MMP-2表達(dá)水平降低，表明干擾STAT3的表達(dá)能明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在卵巢癌的治療過(guò)程中，最關(guān)鍵的因素是控制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Vermeij等[12]在對(duì)52例浸潤(rùn)上皮性卵巢癌患者的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，如果抑制STAT3的表達(dá)，可減少卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生。因此，STAT3有可能成為判斷卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)重要指標(biāo)，同時(shí)也為卵巢癌的基因治療提供了新的途徑。

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