陳延杰，陳衛(wèi)東

(安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230038)

固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles)給藥系統(tǒng)是目前亞微粒給藥系統(tǒng)的發(fā)展熱點。它以生理相容的高熔點脂質(zhì)為骨架材料制備，將藥物包裹或內(nèi)嵌于類脂核中，制成粒徑約為50～1000 nm的固體膠粒給藥系統(tǒng)，副作用小，室溫及體溫下呈固態(tài)粒子[1－2]。新藤黃酸(neo－gambogid acid)是從中藥藤黃中分離出的一種具有較高抗腫瘤活性的化合物，抗癌譜廣，對人肝癌細(xì)胞Bel－7402、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT－8以及人卵巢癌細(xì)胞A2780的增殖均有明顯抑制作用[3]。但新藤黃酸水溶性差，而且靜脈給藥時有強(qiáng)烈的血管刺激性，限制了其臨床應(yīng)用。此外，新藤黃酸在體內(nèi)的半衰期短，對治療效果也有很大的影響。結(jié)合臨床需求和目前制劑的發(fā)展情況，筆者將新藤黃酸藥制備成固體脂質(zhì)納米粒，控制粒徑大小，期望減小新藤黃酸的血管刺激性，提高體內(nèi)生物利用度，更好地發(fā)揮其藥理作用。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(LC－20AB泵，SPD－M20A紫外檢測器及島津LC－solution色譜工作站);H－800型透射電子顯微鏡(日本日立公司);Delsa nano C型粒度分析儀(美國Beckman Coulter公司);UV－2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司);CP225D型電子天平(德國賽多利斯公司);85－2型恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠);HH－S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)。新藤黃酸原料藥(安徽中醫(yī)學(xué)院藥化教研室提供);卵磷脂(安徽豐原藥業(yè)股份有限公司提供);泊洛沙姆188(德國BASF公司，批號為WO39846);單硬脂酸甘油酯(汕頭市西隴化工廠有限公司，批號為0906012);吐溫－80(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為F20050721);葡聚糖凝膠G－50(美國Pharmacia公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒制備

取處方量的新藤黃酸、單硬脂酸甘油酯、卵磷脂溶于適量無水乙醇中，于(75±2)℃水浴下形成有機(jī)相。另取泊洛沙姆溶于蒸餾水中，加入少量吐溫－80，加熱至與有機(jī)相相同溫度，構(gòu)成水相。在攪拌過程中用針頭將有機(jī)相注入水相，按照每秒1滴的速度，整個過程中反應(yīng)溫度要保持在脂質(zhì)材料的熔點之上。攪拌1 h，待無水乙醇揮干，將所得的半透明體系快速分散于0～2℃的冰水中，并且冰浴攪拌30 min，即得納米?；鞈乙?。

2.2 外觀與粒徑

按照優(yōu)化后的處方制備樣品，將樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸溶液負(fù)染，然后滴至銅網(wǎng)上，室溫放置至形成薄膜后，用透射電子顯微鏡觀察。由圖1可見，新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒為具有黃色乳光膠體溶液，電鏡下觀察納米粒為許多圓形或橢圓形球粒，平均粒徑為(113±6)nm。

2.3 包封率測定

2.3.1 檢測波長選擇

精密稱取新藤黃酸2 mg對照品，用甲醇溶解稀釋，定容到10 mL容量瓶中，振搖作為新藤黃酸濃貯備液。以濃貯備液濃度配制質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的新藤黃酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，同法配制空白溶液作參比，用紫外分光光度計于200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果新藤黃酸在360 nm波長處有最大吸收，故選擇360 nm為檢測波長。

2.3.2 色譜條件

色譜柱:Lichrospher C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－0.1% 磷酸(9 ∶1);流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:360 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:取新藤黃酸對照品溶液、空白固體脂質(zhì)納米粒破乳溶液和新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒破乳溶液各20 μL進(jìn)樣分析，色譜圖見圖2。結(jié)果顯示輔料對藥物含量測定無干擾。

線性關(guān)系考察:精密吸取不同體積的貯備液，流動相分別稀釋成 50，25，10，1.0，0.1μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 20 μL 進(jìn)樣，在按2.2.2項下色譜條件進(jìn)行測定，計算峰面積。結(jié)果表明，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 A=30992 C－18289，r2=0.9995。

圖1 透射電鏡圖

圖2 高效液相色譜圖

加樣回收試驗:按處方比例加入1 mL空白固體脂質(zhì)納米粒溶液至編號為 1，2，3的10 mL量瓶中，依次精確加入上述新藤黃酸貯備液 0.5，1，2 mL，以甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度10～40μg/mL的樣品溶液，分別進(jìn)樣20μL，測定峰面積，連續(xù)3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成實際測定濃度，計算回收率。結(jié)果平均加樣回收率為99.3%，RSD為1.12%。

精密度試驗:取同一新藤黃酸對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。結(jié)果峰面積的 RSD為1.02%，表明方法精密度良好。

包封率測定[4]:以Sephadex G－50葡聚糖凝膠柱色譜法分離和游離藥物，測定其包封率。吸取1 mL新藤黃酸固體脂質(zhì)納米?；鞈乙荷现?，蒸餾水洗脫，收集帶有乳光部分的洗脫液，每2 mL收集1次，加甲醇并超聲破乳。另吸取1 mL新藤黃酸固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，直接加甲醇破乳并超聲提取。按2.3.2項下色譜條件分別測定兩樣品中新藤黃酸的含量，按公式包封率=m柱/m總計算包封率。m柱為新藤黃酸固體脂質(zhì)納米?；鞈乙和ㄟ^Sephadex G－50后測得的新藤黃酸的含量;m總為新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒混懸液直接破乳后測得的新藤黃酸的含量。按處方量進(jìn)行了3次重復(fù)驗證試驗，制備 3批固體脂質(zhì)納米粒，得平均包封率為(60.1±1.1)%。

2.4 正交試驗與方差分析

在單因素考察試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定單硬脂酸甘油酯(因素A)、泊洛沙姆用量(因素B)、乳化時間(因素C)、單硬脂酸甘油酯與卵磷脂比(因素D)4個因素，每個因素設(shè)定3個水平，進(jìn)行正交設(shè)計試驗，以包封率為考察指標(biāo)篩選最佳處方及工藝參數(shù)。因素水平設(shè)計見表1，試驗結(jié)果見表2和表3?？芍?，本試驗4個因素影響程度為A＞D＞C＞B，方差分析結(jié)果表明，A和B因素有顯著影響，初步確定最佳制備工藝為A2B1C1D3，即單硬脂酸甘油酯15 mg，泊洛沙姆濃度為0.8%，攪拌時間1 h，卵磷脂30 mg。

表1 因素水平設(shè)計表

2.5 工藝的驗證與確定

根據(jù)2.4項下確定的最優(yōu)處方和工藝條件平行制備3批載藥固體脂質(zhì)納米粒，分別測定其包封率和載藥量，確定乳化蒸發(fā)－低溫固化法的工藝流程，結(jié)果見表4。驗證結(jié)果表明最佳處方重復(fù)性強(qiáng)，包封率和載藥量保持穩(wěn)定。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.6 納米粒粒徑與電位的測定

取新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒混懸液適當(dāng)稀釋后，用納米激光粒度儀測定粒徑及分布，結(jié)果見圖3、圖4。結(jié)果表明制得的平均粒徑為163.3 nm，粒徑大小相近，Zeta電位為－16.9 mV。

表4 重復(fù)最佳處方制備的固體脂質(zhì)納米粒的包封率和載藥量(%)

圖3 新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒粒度分布圖

3 討論

本試驗采用高溫乳化－低溫固化法制備新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒，載體材料為單硬脂酸甘油酯和卵磷脂，表面活性劑以泊洛沙姆為主，吐溫－80為輔，兩者混合使用可得到比較理想的固體脂質(zhì)納米粒，控制粒徑在100～200 nm范圍內(nèi)。

圖4 新藤黃酸固體脂質(zhì)納米粒Zeta電位圖

單硬脂酸甘油酯的熔點在55℃左右，在制備過程中反應(yīng)溫度應(yīng)高于熔點，最終確定反應(yīng)溫度為(75±2)℃ 。制備初乳時，攪拌速率對反應(yīng)過程有較大的影響:攪拌速率過低，反應(yīng)不完全，有機(jī)溶劑揮發(fā)不完全，造成有溶劑殘留;而轉(zhuǎn)速過大，乳化時會產(chǎn)生大量泡沫，影響表面活性劑的效果，最終確定轉(zhuǎn)速為1000 r/min。該方法固化的過程實際也是稀釋的過程，故所得混懸液的固體含量較低，粒子比較分散。

試驗中發(fā)現(xiàn)，固體脂質(zhì)納米粒穩(wěn)定性不理想，放置一段時間后會有沉淀析出，可能是受周圍光線、溫度、濕度影響，造成晶型的改變[5]，從β'轉(zhuǎn)變成β1，使晶格轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致部分沉淀在混懸液中析出。期待進(jìn)一步試驗，將固體脂質(zhì)納米?；鞈乙鹤龀蓛龈煞?，以加強(qiáng)它的穩(wěn)定性。

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[5]Freitas C，Muller RH.Stability determination of solid lipid nanoparticles(SLN)in aqueous dispersion after addition of electrolyte[J].J Microencapsul，1999，16(1):59－71.