胡春玲，唐尹萍，施靜妮，劉焱文

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點實驗室，武漢 430065)

鱉甲(Trionyx sinensis carapace)為傳統(tǒng)中藥，來源于鱉科動物鱉(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲。臨床上，以鱉甲為君藥的多種中藥復(fù)方用于治療肝纖維化療效顯著。單味鱉甲也常用于治療慢性肝病，預(yù)防肝硬化，是臨床上治療肝硬化應(yīng)用最廣的藥物之一［1-2］。筆者前期研究工作已證實鱉甲煎煮液對大鼠肝纖維化有較好的抑制作用［3］，并首次從鱉甲中分離出活性成分，藥理實驗證明其抗肝纖維化效果顯著［4-8］，但其來源有限，應(yīng)用受到極大限制。筆者在本實驗中選取鱉甲活性成分之一抗肝纖維化活性多肽(NPNPT，m/z 542.16)進行多肽固相合成，經(jīng)反相高效液相分析、純化得到鱉甲合成多肽;并應(yīng)用Annexin VFITC/PI流式細胞術(shù)檢測鱉甲合成多肽作用肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)后細胞凋亡情況［9-10］，為篩選、尋找抗肝纖維化多肽藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent1100液相色譜儀(Agilent公司);基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(日本島津公司);臺式冷凍干燥機;二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(日本SANYO公司產(chǎn)品);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司產(chǎn)品);EEPICSXL型流式細胞儀(美國BECKMANCOUNTER公司)。

1.1.2 試劑 大鼠肝星狀細胞系(HSC-T6，浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝病研究所提供);High-DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司);胎牛血清(武漢三利生物技術(shù)有限公司);Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國羅氏公司);Na-芴甲基氧羰基保護的氨基酸(Fmoc-AA)、Wang樹脂、1-氧-3-雙二甲胺羰基苯并三氮唑四氟化硼鹽(TBTU，吉爾生化上海有限公司生產(chǎn));其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 鱉甲活性多肽的固相合成 根據(jù)鱉甲NPNPT的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，采用固相合成法，以Fmoc保護氨基酸和Wang樹脂為原料，經(jīng)1-氧-3-雙二甲胺羧基苯并三氮唑四氟化硼鹽(TBTU)、N-甲基嗎啡啉(nmethylmorpholine，NMM)縮合，以20%哌啶的二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)溶液進行脫保護，用TFA切割試劑將多肽粗品從Wang樹脂上切割下來。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將HSC-T6培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·mL-1鏈霉素和 1%NEAA的High-DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);在倒置顯微鏡下觀察細胞長到亞單層或細胞密度80%～90%時，是HSC-T6傳代的標(biāo)志;吸棄培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按1∶4傳代。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測早期細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，以1×105個·mL-1密度接種于50mL培養(yǎng)瓶中，24 h后加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制的各濃度鱉甲合成多肽(0，0.6，1.2，2.5，5.0 mg·mL-1)培養(yǎng)24 h，收集所有細胞，根據(jù) Annexin V-FITC/PI試劑盒說明，流式細胞儀檢測HSC凋亡。以加入鱉甲合成多肽濃度0 mg·mL-1組為對照組。

2 結(jié)果

2.1 鱉甲合成多肽的鑒定結(jié)果 采用經(jīng)典的多肽固相合成方法，按照鱉甲抗肝纖維化活性多肽的氨基酸序列從右到左進行全合成，經(jīng)反相高效液相色譜分析純化，得純度＞98%的合成肽。其質(zhì)譜圖見圖1。由圖可以得到合成多肽的相對分子質(zhì)量為542.083，與對應(yīng)鱉甲抗肝纖維化活性多肽NPNPT(m/z為542.16)的理論相對分子質(zhì)量一致，證明合成多肽即為目的產(chǎn)物。

圖1 合成多肽N-P-N-P-T的質(zhì)譜鑒定圖Fig.1 Mass spectrum analysis of synthetic peptide N-PN-P-T

2.2 鱉甲合成多肽對 HSC早期凋亡的影響Annexin V-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，0.6，1.2，2.5和 5.0 mg·mL-1鱉甲合成多肽與 HSC-T6細胞作用24 h后，早期凋亡率分別為(9.56±1.27)%，(28.90±3.11)%，(57.96±5.17)%和(87.17±10.85)%，與空白對照組［早期凋亡率(2.85±0.58)%］比較，均明顯增高;高劑量組之間凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

3 討論

圖2 流式細胞術(shù)檢測鱉甲合成多肽對HSC-T6早期凋亡的影響A.空白對照組;B.鱉甲合成多肽 0.6 mg·mL-1組;C.鱉甲合成多肽 1.2 mg·mL-1組;D.鱉甲合成多肽 2.5 mg·mL-1組;E.鱉甲合成多肽 5.0 mg·mL-1組;Fig.2 Detection of apoptosis of HSC-T6induced by synthetic peptide of Carapax Trionycis by flow cytometryA.blank control group;B.0.6 mg·mL-1synthetic peptide group;C.1.2 mg·mL-1synthetic peptide group;D.2.5 mg·mL-1 synthetic peptide group;E.5.0 mg·mL-1synthetic peptide group

以鱉甲抗肝纖維化活性成分為先導(dǎo)化合物，進行全化學(xué)合成，是當(dāng)今尋找安全、高效抗肝纖維化藥物的重要途徑。本實驗結(jié)果表明，根據(jù)鱉甲抗肝纖維化活性多肽的序列結(jié)構(gòu)，采用Fmoc固相方法對多肽進行全合成，經(jīng)反相高效液相色譜法分析、純化得到純度高、相對分子質(zhì)量為與理論值一致的合成多肽，說明通過全合成的方法完全可以得到與天然多肽結(jié)構(gòu)一致的鱉甲合成多肽。

HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［11-12］，有效干預(yù)HSC的生物學(xué)行為則能成功防治肝纖維化，其中誘導(dǎo)活化的肝星狀細胞凋亡是目前治療肝纖維化的主要機制之一，Annexin V-FITC/PI雙染法是常見的定量檢測細胞凋亡的方法。本實驗經(jīng)Annexin V-FITC/PI法檢測HSC凋亡，發(fā)現(xiàn)鱉甲合成多肽可以誘導(dǎo)HSC的凋亡，抑制HSC增殖，發(fā)揮抗肝纖維化的功能，且其作用呈劑量依賴性?？傊?，通過鱉甲多肽的固相合成及Annexin V-FITC/PI法檢測鱉甲合成多肽誘導(dǎo)HSC凋亡，為目前篩選、尋找抗肝纖維化多肽藥物提供理論依據(jù)。

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