張懷斌，張曉帆，李懷祥

(1.濱州醫(yī)學(xué)院(煙臺(tái)校區(qū))藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

血清白蛋白(Serum albumin，SA)是血漿中含量最豐富的載體蛋白[1]。牛血清白蛋白(BSA)因與人血清白蛋白(HSA)具有相似的結(jié)構(gòu)，常被作為體外模型進(jìn)行研究[2]。蛋白質(zhì)分子中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸而產(chǎn)生內(nèi)源性熒光，因此可為藥物與血清白蛋白的結(jié)合作用研究提供有用的信息，為研究藥物在體內(nèi)的分布、藥效的發(fā)揮等提供重要的依據(jù)[3，4]。

槲皮素(Quercetin，Que)是自然界廣泛分布的一種黃酮類化合物，生物活性顯著，具有抗氧化、抗癌、消炎及清除自由基等功效[5]。槲皮素與生物大分子的結(jié)合作用已成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)，其中針對(duì)Que與BSA的結(jié)合作用已有相關(guān)研究[3～9]。Que 結(jié)構(gòu)中存在3-羥基-4-酮、3′，4′-二羥基、5-羥基-4-酮三個(gè)配位點(diǎn)，可與金屬離子形成穩(wěn)定的配位結(jié)構(gòu)[3，4]。研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+存在下Que與BSA的結(jié)合作用減弱；而呂鑒泉等[9]發(fā)現(xiàn)Ca2+能夠使Que與BSA的結(jié)合作用增強(qiáng)。可見(jiàn)，不同金屬離子對(duì)Que與BSA的結(jié)合作用會(huì)產(chǎn)生不同的影響。近年來(lái)稀土在農(nóng)業(yè)、材料及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，稀土在應(yīng)用過(guò)程中對(duì)生命體健康的影響成為人們關(guān)注的重點(diǎn)[10，11]。

熒光光譜是研究蛋白質(zhì)與小分子作用的重要手段。當(dāng)血清白蛋白與某些小分子結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致熒光猝滅，其猝滅機(jī)制常根據(jù)Stern-Volmer方程[8，9，12]確定：

F0/F=1+KSVcq=1+Kqτ0cq

(1)

式中:F和F0分別為有、無(wú)猝滅劑時(shí)體系的熒光強(qiáng)度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；cq為猝滅劑的濃度；Kq為熒光猝滅速率常數(shù)；τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)生物大分子的平均壽命(約為10-8s)。

在靜態(tài)猝滅作用中，存在：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgcq

(2)

以lg[(F0-F)/F]對(duì)lgcq作圖可求得蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，當(dāng)溫度變化不大時(shí)，結(jié)合反應(yīng)的焓變△H可看成一個(gè)常數(shù)，根據(jù)熱力學(xué)公式(3)、(4)可求得結(jié)合作用的熱力學(xué)參數(shù)[2，8]。

ln(K2/K1)=△H(1/T1-1/T2)/R

(3)

△G=△H-T△S=-RTlnK

(4)

鑒于此，作者以Que為藥物小分子、BSA為藥物作用的底物，采用熒光光譜、紫外吸收光譜、紅外光譜研究稀土離子Eu3+對(duì)Que與BSA結(jié)合作用的影響，分析了Eu3+存在下結(jié)合作用減弱的原因，擬為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用提供有價(jià)值的信息。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白(純度>98%)、槲皮素(生化試劑)，上海生物工程有限公司；Tris試劑、氯化鈉、鹽酸、氧化銪，均為分析純；溶劑為二次去離子水。將氧化銪按化學(xué)反應(yīng)劑量溶于鹽酸中，配制成1.0×10-2mol·L-1的EuCl3溶液；用pH值為7.4的0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(內(nèi)含0.05 mol·L-1NaCl維持離子強(qiáng)度)配制濃度為1.01×10-6mol·L-1的BSA溶液；配制濃度為1.1×10-4mol·L-1的甲醇水溶液(1∶1，體積比)。

LS-55型熒光分光光度計(jì)，美國(guó)Perkin Elmer公司；WQF-510 FTIR型傅立葉紅外光譜儀，北京瑞利分析儀器公司；756PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器，上海醫(yī)大儀器廠；PHS-3C型酸度計(jì)，上海精密儀器有限公司；DK-S型兩孔四列恒溫水浴鍋，煙臺(tái)龍口先科儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜測(cè)定

取3 mL BSA于石英比色皿中，分別加入不同量的Que(每次加入10 μL，加入總體積<100 μL，忽略體積對(duì)濃度的影響)，固定激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm、熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度比為6∶8、掃描速率為500 nm·min-1，分別于溫度為299 K、311 K時(shí)測(cè)定BSA 300～450 nm的發(fā)射光譜，記錄350 nm處的熒光強(qiáng)度。

在上述溶液中維持Eu3+的濃度分別為1.0×10-6mol·L-1、1.0×10-5mol·L-1、1.0×10-4mol·L-1，重復(fù)上述步驟。

1.2.2 紫外光譜、紅外光譜測(cè)定

在pH值為7.4的Tris-HCl介質(zhì)中，測(cè)定Eu3+與Que摩爾比為0、1∶3、2∶3、3∶3時(shí)的紫外光譜。

Eu3+與Que以摩爾比2∶1混合，靜置18 h，用去離子水反復(fù)洗滌、離心，干燥后測(cè)定紅外光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 Eu3+存在下，Que對(duì)BSA熒光猝滅的影響

圖1A～D分別為Eu3+濃度為0 mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1、1.0×10-5mol·L-1、1.0×10-4mol·L-1條件下，Que對(duì)BSA熒光光譜猝滅的影響。

cq(×10-8 mol·L-1)，1～6:3.7，7.4，11.1，15.1，18.5，22.2

由圖1A可知，BSA的最大發(fā)射峰位于350 nm處，隨著Que濃度的增大，BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，最大發(fā)射峰從350 nm藍(lán)移至347 nm，BSA的峰形沒(méi)有發(fā)生變化。表明Que與BSA之間發(fā)生了結(jié)合作用，但沒(méi)有破壞BSA的發(fā)色團(tuán)。BSA溶液中加入Eu3+后，隨著Eu3+濃度的增大，BSA熒光光譜略有藍(lán)移，當(dāng)Eu3+濃度為1.0×10-4mol·L-1時(shí)藍(lán)移0.9 nm(圖1D)。Eu3+存在下Que對(duì)BSA的熒光猝滅程度減小，發(fā)射峰藍(lán)移程度也減小，但峰形沒(méi)有發(fā)生明顯變化。說(shuō)明Eu3+對(duì)Que與BSA的結(jié)合作用具有一定的影響。

根據(jù)Stern-Volmer方程作出Que對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線，如圖2所示。

圖2 Eu3+存在下，Que與BSA結(jié)合作用的Stern-Volmer曲線

由直線的斜率求出299 K時(shí)不同Eu3+濃度下Que對(duì)BSA的猝滅常數(shù)KSV和猝滅速率常數(shù)Kq，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同Eu3+濃度下，Que對(duì)BSA的猝滅常數(shù)及猝滅速率常數(shù)

由表1可以看出，Kq值均遠(yuǎn)大于動(dòng)態(tài)擴(kuò)散控制的猝滅速率常數(shù)1010L·mol-1·s-1[13]，初步推測(cè)靜態(tài)猝滅在整個(gè)猝滅過(guò)程中起主導(dǎo)作用；Eu3+的存在，使Que對(duì)BSA的猝滅作用減弱，但沒(méi)有改變Que與BSA的作用機(jī)制。

動(dòng)態(tài)猝滅隨溫度的升高，有效碰撞加劇，猝滅常數(shù)增大；靜態(tài)猝滅則相反[13]。圖3為299 K、311 K時(shí)Que與BSA結(jié)合作用的Stern-Volmer曲線。

圖3 不同溫度下，Que與BSA結(jié)合作用的Stern-Volmer曲線

由圖3可以看出，猝滅常數(shù)隨溫度升高而減小，進(jìn)一步證明靜態(tài)猝滅在整個(gè)過(guò)程中占主導(dǎo)作用。

2.2 Eu3+對(duì)Que與BSA結(jié)合作用及熱力學(xué)參數(shù)的影響

以lg[(F0-F)/F]對(duì)lgcq作圖，結(jié)果見(jiàn)圖4；回歸方程及299 K時(shí)Que與BSA的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2；不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

圖4 lg[(F0-F)/F]與lgcq的關(guān)系

表2 不同Eu3+濃度下，Que與BSA結(jié)合的回歸方程、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及相關(guān)系數(shù)(T=299 K)

表3 不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)

由表2可以看出，隨著Eu3+濃度的增大，Que與BSA的KA及n均逐漸減小，其相關(guān)系數(shù)也相應(yīng)減小。說(shuō)明Eu3+影響了Que與BSA的結(jié)合作用。

由表3可以看出，隨著溫度的升高，不管Eu3+是否存在，Que與BSA的結(jié)合常數(shù)KA均增大。

2.3 Eu3+存在下Que與BSA結(jié)合作用減弱的因素分析

Chen在研究Zn2+對(duì)Que與BSA結(jié)合作用的影響時(shí)指出[3，4]：Zn2+能夠使BSA的發(fā)射峰顯著藍(lán)移及BSA與Que結(jié)合作用的猝滅速率常數(shù)增大、結(jié)合常數(shù)減?。籞n2+存在下Que與BSA的結(jié)合在很大程度上是Zn2+-Que與BSA的結(jié)合作用。而在本實(shí)驗(yàn)中，將Eu3+加入到BSA中，BSA的發(fā)射峰位置并未發(fā)生明顯藍(lán)移，當(dāng)其濃度達(dá)到1.0×10-4mol·L-1時(shí)，僅藍(lán)移0.9 nm，且Eu3+的存在使得Que對(duì)BSA作用時(shí)藍(lán)移程度降低(圖1)。Eu3+的存在，雖未改變Que對(duì)BSA的猝滅機(jī)制，但其猝滅常數(shù)、猝滅速率常數(shù)及結(jié)合常數(shù)均減小，這說(shuō)明，Eu3+阻礙了Que與BSA的結(jié)合，并未參與協(xié)同猝滅。此外，從表2可知，體系中Eu3+濃度的增大，lg[(F0-F)/F]與lgcq之間的相關(guān)系數(shù)R減??；當(dāng)Eu3+濃度為1.0×10-4mol·L-1時(shí)，R值較大地偏離1.000，這也進(jìn)一步說(shuō)明Eu3+的存在影響了Que與BSA的結(jié)合作用，當(dāng)Eu3+濃度增大到一定程度時(shí)，有可能改變Que與BSA的作用機(jī)制。這些表明Eu3+對(duì)Que與BSA結(jié)合作用的影響與Zn2+相比有所差別。

Eu3+存在時(shí)Que與BSA的結(jié)合作用減弱，可能有如下幾點(diǎn)原因：

(1)在pH=7.4時(shí)，BSA(等電點(diǎn)約為4.6)帶有較多負(fù)電荷，Eu3+帶有3個(gè)正電荷，Eu3+與BSA有較強(qiáng)的靜電引力，在作用過(guò)程中有競(jìng)爭(zhēng)作用，很大程度上限制了Que與BSA的結(jié)合。文獻(xiàn)[11]中Eu3+與人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)為1012L·mol-1，而本實(shí)驗(yàn)中Que與BSA的結(jié)合常數(shù)為105L·mol-1，Eu3+與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Que與BSA的結(jié)合常數(shù)，因此，在Eu3+、Que同時(shí)與BSA作用時(shí)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，使得Que與BSA的結(jié)合常數(shù)減小。

(2)Eu3+與BSA的結(jié)合及大量的Eu3+分散在BSA外側(cè)，增大了Que與BSA之間的阻力，使二者的結(jié)合作用變得困難，要發(fā)生同樣的作用需要更多的能量。從表3可知：△S>0，分子之間的相互作用力主要為疏水作用力；△G<0，反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行；△H>0，反應(yīng)是吸熱過(guò)程，溫度升高有利于反應(yīng)向正反應(yīng)進(jìn)行，因此結(jié)合常數(shù)隨溫度升高而增大[14]。Eu3+存在下改變了BSA的結(jié)構(gòu)及微環(huán)境，△G雖然仍小于零，但與不存在時(shí)相比有所增大，自發(fā)進(jìn)行反應(yīng)的趨勢(shì)降低，同時(shí)△H、△S有所增大，說(shuō)明Que與BSA發(fā)生相同的變化需要吸收的熱量更多，Eu3+存在時(shí)，反應(yīng)熵驅(qū)動(dòng)過(guò)程更明顯。這進(jìn)一步證實(shí)Eu3+的存在不利于Que與BSA的結(jié)合。

(3)有可能生成Eu3+-Que配合物，抑制Que與BSA的結(jié)合。Que在紫外區(qū)有2個(gè)吸收帶，分別位于256 nm和375 nm[4]。從pH值為7.4的Tris-HCl介質(zhì)中不同Eu3+與Que摩爾比的紫外光譜(圖5)可以看出，256 nm和375 nm兩吸收帶分別紅移到了290 nm和392 nm，并且在320 nm處出現(xiàn)一弱的吸收峰，這可能與介質(zhì)溶液及Que的存在形式有關(guān)。隨著Eu3+濃度的增大，290 nm和392 nm處吸收強(qiáng)度明顯減弱，320 nm吸收帶增強(qiáng)，290 nm和320 nm吸收帶分別紅移了4 nm和10 nm，460 nm處出現(xiàn)一新的吸收峰且吸收強(qiáng)度不斷增大，在278 nm、352 nm、430 nm處出現(xiàn)3個(gè)等吸收點(diǎn)。上述結(jié)果顯示，在pH值為7.4的Tris-HCl介質(zhì)溶液中Eu3+與Que極易形成配位結(jié)構(gòu)。

Eu3+ 與Que摩爾比，1～4：0、1∶3、2∶3、3∶3

Eu3+存在下Que的紅外光譜(圖6)中C=O振動(dòng)峰、C-OH振動(dòng)峰的消失均顯示有配位結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)一步證實(shí)了Eu3+-Que配合物的生成。Eu3+與Que的結(jié)合降低了溶液中Que的濃度，同時(shí)Eu3+-Que配合物有可能抑制Que與BSA的作用，從而使得Que與BSA的結(jié)合作用減弱。

圖6 Eu3+存在下Que的紅外光譜

3 結(jié)論

在模擬動(dòng)物體生理?xiàng)l件下，運(yùn)用熒光光譜、紫外吸收光譜、紅外光譜研究了Que與BSA的結(jié)合作用。結(jié)果表明，Que對(duì)BSA的熒光光譜具有猝滅作用，其猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，Eu3+的存在使得BSA發(fā)射峰藍(lán)移程度降低，猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均減小，但沒(méi)有改變Que與BSA的作用機(jī)制。在較大濃度Eu3+存在下，Que與BSA結(jié)合作用的相關(guān)系數(shù)減小。分析認(rèn)為，Eu3+與Que在與BSA結(jié)合上存在競(jìng)爭(zhēng)作用，Eu3+與BSA有較強(qiáng)的靜電引力，過(guò)量的Eu3+分散在BSA外側(cè)，增大了Que與BSA之間的阻力，要發(fā)生同樣的反應(yīng)吸收的熱量更多；另外，在Que結(jié)構(gòu)中存在配位點(diǎn)，可與金屬離子形成穩(wěn)定的配位結(jié)構(gòu)，可能生成的Eu3+-Que配合物抑制了Que與BSA的結(jié)合。因此，Que與BSA的結(jié)合作用減弱是多種因素作用導(dǎo)致的。為研究Eu3+的生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)及Eu3+存在下Que的藥理、毒理作用提供了重要信息。

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