王志力 ，梁紅寶 ，伍久林 ，陳 立 ，張其清 ,2*

1.福州大學(xué)生物和醫(yī)藥技術(shù)研究院，福建福州 350002；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192

石決明為海產(chǎn)鮑科軟體動(dòng)物鮑魚（abalone）的貝殼，是一種名貴的動(dòng)物類中藥，具有平肝潛陽(yáng)、清肝明目的功效。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，鮑魚是一種重要的經(jīng)濟(jì)軟體動(dòng)物[1]，主要分布在東亞地區(qū)[2]，中國(guó)作為最大的鮑魚生產(chǎn)國(guó)，每年要產(chǎn)生大量的鮑魚殼，以致形成石決明藥材產(chǎn)量過(guò)剩的局面。因此，有必要開(kāi)展鮑魚殼高附加值生物活性提取物方面的研究，填補(bǔ)該類中藥開(kāi)發(fā)研究領(lǐng)域的空白。

石決明同其他貝殼類物質(zhì)一樣，含有大量的碳酸鈣、多種微量元素[4-5]和蛋白質(zhì)成分等有機(jī)物。目前，對(duì)石決明的研究多集中在其成分、結(jié)構(gòu)及兩者的相關(guān)性方面，而對(duì)具有生物活性的藥效成分的研究卻鮮有報(bào)道?？寡趸饔檬欠乐味喾N疾病的重要藥效機(jī)制之一。本文采用生化分離方法對(duì)石決明成分進(jìn)行分離，并通過(guò)對(duì)各成分體外清除DPPH自由基活性的研究，發(fā)現(xiàn)石決明含有多種抗氧化活性成分，為闡釋石決明藥理學(xué)作用機(jī)制提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器和設(shè)備

TP-114電子天平（美國(guó)Sartorius Denver公司），D8C真空泵（德國(guó)Ernst Leybold公司），旋轉(zhuǎn)常溫濃縮儀（日本EYELA公司），Primo R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific公司），蛋白電泳儀（美國(guó)GE公司），離子交換層析系統(tǒng)（日本島津公司），Aquapro超純水機(jī)（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司），UV-1600紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.2 材料和試劑

閩產(chǎn)雜色鮑 （haliotis diversicolor reeve）（來(lái)自福建誼來(lái)鮑魚制品有限公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical-2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]（由 Alfa Aesar公司提供），羧甲基葡聚糖凝膠C-25（CM-Sephadex C-25）（美國(guó)General Electric公司生產(chǎn)），蛋白Marker（美國(guó)Fermentas公司生產(chǎn)），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品處理

將雜色鮑貝殼剝離后用去離子水清洗干凈，常溫鼓風(fēng)干燥至恒重，用粉碎機(jī)把鮑魚殼粉碎成200目以上的粉末，稱取200 g，加入5%稀酸溶液500 ml，4℃攪拌至沒(méi)有氣泡產(chǎn)生，用稀堿溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，過(guò)濾，取濾液，低溫高速離心15 min，取上清液，低壓濃縮蒸發(fā)至50 ml，低溫透析24 h，透析液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 離子交換色譜分析

用CM-Sephadex C-25離子交換色譜系統(tǒng)分離“2.1”項(xiàng)下制備的石決明提取液，洗脫條件為：0～1.0 mol/L溶解在20 mmol/L PBS（pH 8.0）緩沖液中的NaCl溶液線性梯度洗脫IEC上樣層析柱，流速為1.0 ml/min，紫外吸收波長(zhǎng)為280 nm光密度（OD280nm）檢測(cè)，自動(dòng)收集器每管3 ml收集洗脫液，24 h低溫透析，4℃保存?zhèn)溆?。共制?0管。

2.3 蛋白成分檢測(cè)

[6]的方法，SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析“2.2”項(xiàng)下序號(hào)為 18、20、25、34、38、45 收集管的蛋白組分（依據(jù)“2.2”項(xiàng)下各管OD280nm值，OD280nm值較大者入選），空白對(duì)照用去離子水代替IEC分離樣品，濃度為12%聚丙烯酰胺凝膠作為分離膠，考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色。

2.4 DPPH·清除活性分析

參考文獻(xiàn)[7]的方法，對(duì)“2.2”項(xiàng)下各管收集物的DPPH自由基清除能力進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系包括：0.5 mg/ml樣品溶液 0.2 ml，2.0×10-4mol/L DPPH 溶液 2.0 ml，加超純水至反應(yīng)總體積為4 ml。37℃水浴條件下避光反應(yīng)30 min，空白實(shí)驗(yàn)以等體積無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，對(duì)照以等體積去離子水代替樣品溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為517 nm。DPPH·清除率計(jì)算依據(jù)公式：

其中：Ax為加入樣品的吸光度；Axo為樣品的吸光度；Ao為未加樣品的吸光度。

2.5 石決明樣品處理及IEC色譜分析

石決明溶解于稀酸溶液，可觀察到溶液變?yōu)辄S褐色，除去不溶性物質(zhì)后，經(jīng)過(guò)離子交換層析，在280 nm處測(cè)定各管收集液光密度值，得到雙峰洗脫曲線，第一個(gè)峰（對(duì)應(yīng)第25管）洗脫時(shí)間長(zhǎng)，峰型為不對(duì)稱寬峰，推測(cè)該峰包含多種成分。第二個(gè)峰（對(duì)應(yīng)第38管）洗脫時(shí)間短，峰型為尖峰，第38管分離液OD280nm為1.875，位于峰尖位置，可能是一種組成比較簡(jiǎn)單的組分。見(jiàn)圖1。

圖1 CM-Sephadex C-25離子交換層析梯度洗脫石決明提取物色譜

2.6 蛋白成分分析

SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，與色譜峰相對(duì)應(yīng)的第25和第38管溶液均顯示出明顯蛋白條帶，而其余收集組分對(duì)應(yīng)的條帶明顯減弱，第45管與對(duì)照組都沒(méi)有顯示出明顯條帶，所有蛋白條帶均集中在18.4～25.0 kDa分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker蛋白條帶之間，說(shuō)明經(jīng)過(guò)IEC分離得到主要蛋白組分的分子量在18.4～25.0 kDa 之間，與 Michenfelder[8]從紅鮑（haliotis rufescens）貝殼中獲得的礦化連接蛋白AP24分子量相近。見(jiàn)圖2。

圖2 石決明分段分離組分SDS-PAGE電泳

2.7 DPPH自由基清除能力測(cè)定

清除DPPH自由基活性測(cè)試結(jié)果表明，石決明溶液經(jīng)過(guò)IEC色譜分離后的第18、38、55管以后各分離樣品均具有較高DPPH自由基清除能力，第60管以后樣品的DPPH自由基清除率能達(dá)到45%以上。第38管樣品在280 nm處有最大吸收，而且蛋白電泳條帶明顯，說(shuō)明石決明可能含有具有抗氧化活性的蛋白組分。見(jiàn)圖3。

圖3 石決明提取物對(duì)DPPH自由基清除率

3 討論

石決明是臨床常用的中藥之一，由角質(zhì)層、棱柱層和珍珠層組成，其有機(jī)組分主要存在于珍珠層。貝殼珍珠層與珍珠成分非常相似，而后者水提液能顯著提高小鼠體內(nèi)過(guò)氧化物歧化酶活性，降低過(guò)氧化產(chǎn)物水平[9-10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，珍珠層成分具有很高的活性氧自由基清除活性[11]，與本研究結(jié)論相近，推測(cè)貝殼珍珠層與珍珠具有相似的活性氧自由基清除活性成分，可以作為昂貴藥用珍珠的理想替代品，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究根據(jù)石決明酸溶性水提液組分在不同離子濃度條件下對(duì)羧甲基葡聚糖凝膠吸附力的不同，通過(guò)離子交換色譜，獲得了含有不同蛋白成分的分離液，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，各收集管分離物的主要蛋白分子量均在18.4～25.0 kDa之間，而且含量與280 nm處光密度測(cè)量值呈正相關(guān)。IEC色譜分離液DPPH自由基清除能力結(jié)果表明，除部分組分的清除能力與蛋白含量顯著相關(guān)外，其余樣品與蛋白含量的多少不存在相關(guān)性。具有DPPH自由基高清除活性的第18、50管及以后各管組分，在280 nm處沒(méi)有強(qiáng)吸收，也沒(méi)有明顯的蛋白電泳條帶，說(shuō)明石決明除含有抗氧化蛋白成分外，還存在可以清除DPPH自由基的其他高活性物質(zhì)。因此，抗氧化藥效成分可能是石決明藥理學(xué)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，石決明抗氧化作用研究為進(jìn)一步揭示貝殼類中藥的藥用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Chen H,Mai KS,Zhang WB,et al.Effects of dietary pyridoxine on immune responses in abalone,Haliotis discus hannai Ino[J].Fish and Shellfish Immunology,2005,19(3):241-252.

[2]Marchant S,Haye PA,Marin SA,et al.Genetic variability revealed with microsatellite markers in an introduced population of the abalone Haliotis discus hannai Ino[J].Aquaculture Research,2009,40(3):298-304.

[3]陳玉枝,林舒.閩產(chǎn)鮑魚殼中碳酸鈣微量元素和氨基酸的分析[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1999,9(3):28-30.

[4]王志力,陳善飛,方哲翔,等.鮑魚殼蛋白組分研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,10(24):4778-4781.

[5]張剛生,童銀洪.軟體動(dòng)物貝殼中的有機(jī)質(zhì)研究進(jìn)展[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2000,20(1):74-78.

[6]J.薩姆布魯克,D.W.拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(下冊(cè))[M].3版.北京:科學(xué)出版社,2002:55.

[7]Qiao DL,Ke CL,Hu B,et al.Antioxidant activities of polysaccharides from Hyriopsis cumingii[J].Carbohydrate Polymers,2009,78(2):199-204.

[8]Michenfelder M,Fu G,Lawrence C,et al.Characterization of two molluscan crystal-modulating biomineralization proteins and identification of putative mineral binding domains[J].Biopolymers,2003,70(4):522-533.

[9]周大興,吳森林.珍珠水提取液的抗炎、抗氧化作用[J].浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,25(4):41-42.

[10]戴俊,段金廒,李友賓,等.蘇州產(chǎn)淡水珍珠生物活性評(píng)價(jià)及鎮(zhèn)靜活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J].中國(guó)生化藥物雜志,2008,29(5):294-298.

[11]高秋華,黃開(kāi)勛.珍珠層粉水解液預(yù)防白內(nèi)障的作用機(jī)理探討[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),1999,14(3):167-170.