吳正正 嚴(yán) 京 接傳紅 高健生 陳皆春

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是一種世界性的主要致盲眼病。本研究組在前期的實驗研究中已經(jīng)證實密蒙花方對缺氧狀態(tài)下人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì) 胞 （human umbilical vascular endothelial cell，HU-VEC）具有明顯的抑制作用 。在前期實驗研究的基礎(chǔ)上，本實驗進(jìn)一步從血管內(nèi)皮生長因子-血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor-vascular endothelial growth factor receptor，VEGF-VEG FR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制方面深入研究了其具體作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基干粉購自美國GIBCO公司；CoCl2購自 SIGMA公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司。Trizol（美國 Invitrogen）；Taq 酶、Oligo（dT）15Primer、dNTP Mix、M-MLV Reverse Transcriptase 為美國 Promega公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞

HUVEC細(xì)胞株購自南京凱基科技發(fā)展有限公司。

1.3 中藥

購自北京燕北藥材公司，經(jīng)我院中藥房鑒定為道地藥材。黃芪（產(chǎn)于內(nèi)蒙古），女貞子、益母草（產(chǎn)于河北），黃連（產(chǎn)于四川），肉桂（產(chǎn)于廣東），密蒙花（產(chǎn)于湖北）。

2 方法

2.1 密蒙花方水提液制備

密蒙花方所含中藥材沸水浴煎半小時，過濾并收集濾液，取濾渣重復(fù)提取1次，合并2次濾液。加入2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇4℃過夜，離心去除乙醇不溶成分。定容至質(zhì)量濃度為1 g/ml的水提液。微孔濾膜濾過滅菌。

2.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)

待細(xì)胞長滿融合后按1∶3分瓶傳代。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d細(xì)胞可長滿融合。用倒置顯微鏡觀察HUVEC生長情況。

2.3 實驗分組

（1）正常組：RPMI 1640 維持液；（2）缺氧組：正常組 + 終濃度 100μmol/L CoCl2；（3）密蒙花方低濃度組：缺氧組+10 mg/ml密蒙花方水提液；（4）密蒙花方中濃度組：缺氧組+20 mg/ml密蒙花方水提液；（5）密蒙花方高濃度組：缺氧組+40 mg/ml密蒙花方水提液。每組設(shè)6個平行樣本。

2.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測

對細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA、fms 樣酪氨酸激酶（fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)lt-1）mRNA、胎肝激酶-1/激酶插入?yún)^(qū)受體（fetal liver kinase-1/kinase insert domain containing receptor，F(xiàn)lk-1/KDR）mRNA 進(jìn) 行檢測。

2.4.1 細(xì)胞樣本制備：10、20、40 mg/ml密蒙花方水提液分別與100μg/ml CoCl2共同孵育HUVEC 24 h后收獲細(xì)胞，移至不含RNA酶的離心管中，PBS漂洗2次，加入1 ml Trizol試劑，使細(xì)胞充分裂解。-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 RNA的提?。涸诩油闠rizol的細(xì)胞裂解液中加入200μl氯仿，溫和振蕩，室溫靜置，離心。吸取無色上清水相移到另一離心管，水相體積約為Trizol試劑的60%。向上清水相中加入等體積的異丙醇，室溫靜置。離心。去除上清，緩慢沿管壁加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，混勻，離心。吸盡上清。室溫干燥沉淀，加入至30μl焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）處理過的無菌水中，完全溶解，凍存?zhèn)溆?，待RNA鑒定。

2.4.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcription，RT）：反應(yīng)體系：見表1。反應(yīng)條件：42℃水浴反應(yīng)60 min，94℃5 min 終止反應(yīng)。Oligo（dT）序列：TTT TGT ACA AGC TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT。

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

2.4.4 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）：引物設(shè)計：從Pubmed的Gene bank檢索，根據(jù)軟件Primer premier 5設(shè)計引物（引物合成由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司完成）。homo VEGF（AF_022375，245 bp）引物：上游 5’-AAT GCT TTC TCC GCT CTG-3’；下游 5’-CAT CTT CAA GCC ATC CTG-3’。 homo Flt-1（NM_002019，141 bp）引物：上游 5’-ATG CCA CGA ATG AGA ATG-3’；下游 5’-CAG ATG GAC AGC GAT GAG-3’。homo Flk-1/KDR（AF_022375，135 bp）引物：上游 5’-TCA TAA GGC AGT CGT TCA-3’；下游 5’-TCT GGC TAC TTC TTG TCA TC-3’。homo β-Actin（NM_031144.2，205 bp）引物：上游 5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’；下游 5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。 以看家基因β-Actin作為內(nèi)對照進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：見表 2。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 4 min，94℃變性20 s，59℃復(fù)性 25 s，72℃延伸 30 s，進(jìn)行 35 個循環(huán)，隨后72℃終延伸7 min。

表2 聚合酶鏈反應(yīng)體系

2.4.5 2.5%瓊脂糖凝膠電泳：取10μl PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖、120 V電泳30 min，觀察擴(kuò)增結(jié)果，進(jìn)行灰度分析，以 VEGF、Flk-1、Flt-1 與 β-Actin 的光密度比值表示VEGF，F(xiàn)lk-1，F(xiàn)lt-1的表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）來表示。各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

3 結(jié)果

3.1 RNA質(zhì)量鑒定結(jié)果

提取的 RNA 檢測 D（260 nm）/D（280 nm）均介于1.8～2.0之間，表明RNA的純度高。通過甲醛變性凝膠電泳結(jié)果顯示28S和18S條帶邊緣清晰，無拖尾等現(xiàn)象，28S/18S約為2∶1，表明RNA樣品結(jié)構(gòu)完整、無降解，可進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增分析。

3.2 密蒙花方對缺氧狀態(tài)下HUVEC內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的影響

（1）與正常組相比，缺氧組VEGF mRNA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（2）與缺氧組相比，各密蒙花方組VEGF mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（3）各密蒙花方組間比較，隨著密蒙花方濃度的增高，VEGF mRNA表達(dá)逐漸降低，具有劑量依賴性（P＜0.01）（表 3，圖 1）。

3.3 密蒙花方對缺氧狀態(tài)下HUVEC內(nèi)Flt-1 mRNA表達(dá)的影響

（1）與正常組相比，缺氧組Flt-1 mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（2）與缺氧組相比，各密蒙花方組Flt-1 mRNA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（3）各密蒙花方組間比較，密蒙花方高濃度組Flt-1 mRNA表達(dá)較中濃度組高（P＜0.05），低濃度組與中濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表 3，圖 1）。

表3 各組HUVEC內(nèi)VEGF、Flt-1及Flk-1/KDR mRNA的表達(dá)情況（，n=6）

表3 各組HUVEC內(nèi)VEGF、Flt-1及Flk-1/KDR mRNA的表達(dá)情況（，n=6）

注：①缺氧組與正常組比較，P＜0.01；②各密蒙花方組分別與缺氧組比較，P＜0.01；③各密蒙花方組間比較，P＜0.01；④各密蒙花方組間比較，P＜0.05。

組別 VEGF/β-Actin Flt-1/β-Actin Flk-1/β-Actin正常組 0.383±0.021 0.422±0.016 0.360±0.029缺氧組 0.642±0.043① 0.385±0.019① 0.531±0.036①密蒙花方低濃度組 0.520±0.035② 0.442±0.021② 0.484±0.019②密蒙花方中濃度組 0.480±0.020②③ 0.443±0.027② 0.451±0.023②④密蒙花方高濃度組 0.252±0.038②③ 0.486±0.024②④ 0.355±0.025②③

圖1 RT-PCR法檢測各組HUVEC內(nèi)VEGF、Flt-1及Flk-1/KDR mRNA的表達(dá)情況A：正常組；B：缺氧組；C：密蒙花方低濃度組；D：密蒙花方中濃度組；E：密蒙花方高濃度組。Marker從上至下依次為600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp。

3.4 密蒙花方對缺氧狀態(tài)下HUVEC內(nèi)Flk-1/KDR mRNA表達(dá)的影響

（1）與正常組相比，缺氧組 Flk-1/KDR mRNA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（2）與缺氧組相比，各密蒙花方組Flk-1/KDR mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；（3）各密蒙花方組間比較，隨著密蒙花方濃度的增高，F(xiàn)lk-1/KDR mRNA表達(dá)逐漸降低，具有劑量依賴性（表3，圖1）。

4 討論

密蒙花方是我院高健生研究員多年臨床驗證有效的經(jīng)驗方。密蒙花方是在密蒙花，交泰丸（黃連、肉桂）的基礎(chǔ)上加黃芪，女貞子，益母草等藥而成。諸藥相配，具有益氣養(yǎng)陰，和血明目的作用。本研究旨在通過體外實驗研究，從細(xì)胞分子水平、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制方面探討其具體作用機(jī)制。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前所知最強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞選擇性促有絲分裂肽和血管生成因子，既可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及移行，也可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成，同時又是強(qiáng)烈的致通透因子，能顯著增加視網(wǎng)膜血管的通透性〔2〕。其表達(dá)受多種因素調(diào)控，如缺氧、胰島素、糖基化終產(chǎn)物、生長因子等均可刺激血管平滑肌細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等過度表達(dá)VEGF，其中缺氧是最強(qiáng)的誘導(dǎo)因素〔3〕。

血管內(nèi)皮細(xì)胞主要有2種與VEGF高度特異性結(jié)合的受體：fms樣酪氨酸激酶（fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)lt-1）和胎肝激酶-1/激酶插入?yún)^(qū)受體（fetal liver kinase-1/kinase insert domain containing receptor，F(xiàn)lk-1/KDR）。二者均為內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體，但生物學(xué)活性有所差異〔4〕。Flk-1/KDR在VEGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及血管內(nèi)皮生成中起主導(dǎo)作用，主要通過蛋白激酶C-有絲分裂原激活蛋白激酶（protein kinase C-mitogen activated protein kinase，PKC-MAPK）旁路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Flt-1是Flk-1/KDR的一個負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可拮抗Flk-1/KDR的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用。視網(wǎng)膜缺血缺氧可上調(diào)VEGF及其受體表達(dá)，從而通過激活VEGF-VEGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，誘導(dǎo)新生血管生成。有研究表明，阻斷VEGF受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可阻止視網(wǎng)膜新生血管形成〔5〕。

本研究通過采用RT-PCR法檢測密蒙花方對缺氧狀態(tài)下的HUVEC細(xì)胞內(nèi)VEGF及其VEGFR-1，VEGFR-2基因的情況，表明缺氧可以誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞上調(diào)VEGF及Flk-1/KDR的基因表達(dá)，下調(diào)Flt-1的基因表達(dá)，從而促進(jìn)HUVEC增殖。而密蒙花方可以下調(diào)HUVEC細(xì)胞內(nèi)VEGF及Flk-1/KDR的基因表達(dá)，上調(diào)Flt-1的基因表達(dá)，從而有效抑制了缺氧所誘導(dǎo)的HUVEC增殖。本研究說明密蒙花方抑制缺氧狀態(tài)下HUVEC增殖的作用與干預(yù)VEGF-VEGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個復(fù)雜而精確的過程，胞外信號作用于細(xì)胞膜相應(yīng)受體后，可能會經(jīng)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互協(xié)調(diào)共同來完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)任務(wù)〔6〕。在DR的發(fā)生發(fā)展中，除了VEGF-VEGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用之外，還有其它多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮著重要作用，這與血管生成過程的復(fù)雜性一致，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程尚待進(jìn)一步深入研究。

[1]吳正正，高健生，接傳紅，等.密蒙花方對缺氧狀態(tài)下人血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)理研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2008，18（3）：138-140.

[2]Qaum T，Xu Q，Joussen AM，et al.VEGF-initiated blood-retinal barrier breakdown in early diabetes[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2001， 42（10）：2408-2413.

[3]Duh E， Aiello LP.Vascular endothelial growth factor and diabetes：the agonist versus antagonist paradox[J].Diabetes， 1999， 48（10）：1899-1906.

[4]Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors[J].Nat Med， 2003，9（6）：669-676.

[5]Caldwell RB，Bartoli M，Behzadian MA，et al.Vascular endothelial growth factor and diabetic retinopathy：pathophysiological mechanisms and treatment perspectives[J].Diabetes Metab Res Rev，2003，19（6）：442-445.

[6]劉景生.細(xì)胞信息與調(diào)控[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998：176-206.