張成剛，王風清，魏東芝

(華東理工大學生物工程學院 魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237)

甾體激素類藥物是臨床上不可缺少的一類藥物，對機體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[1]。如腎上腺皮質(zhì)激素具有抗炎、抗過敏、抗休克、抗變態(tài)反應等功效，廣泛用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘和濕疹等皮膚病，可治療和緩解膠原性疾病、過敏性休克等難治或危險性疾??；各類性激素是醫(yī)治雄性器官衰退和某些婦科疾病的主要藥物，也是口服避孕藥的主要成分[2]。由于甾類藥物療效獨特，臨床應用廣泛，已成為僅次于抗生素的第二大類藥物，年增長率在15%以上，且藥物的品種也不斷增多。

甾體化合物廣泛存在于動、植物體內(nèi)，但從自然界獲取的這些天然結(jié)構(gòu)的化合物往往活性很低。目前，常用的甾體激素生產(chǎn)方法是利用化學合成和微生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合的工藝路線，即其中的幾步關(guān)鍵反應采用微生物轉(zhuǎn)化法進行，如11α-羥基化、11β-羥基化、A環(huán)的1，2位脫氫等。微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為許多甾體藥物或其中間體合成路線中不可缺少的關(guān)鍵技術(shù)[3]。

甾體母核的1，2位、4，5位、7，8位、9，11位、14，15位及16，17位等都可以采用微生物轉(zhuǎn)化進行脫氫，在這些反應中，尤以C1，2位脫氫反應最為重要。微生物的C1，2位脫氫反應是工業(yè)生產(chǎn)氫化潑尼松及其同系物最有價值的一種反應，也是采用發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)甾類藥物的典型代表。當抗炎甾體激素藥物的母核在C1，2位導入雙鍵后，能成倍地增加其抗炎作用。許多微生物具有3-酮基甾體-1(2)位的脫氫能力，比較常見的有節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)[3～8]、棒狀桿菌屬(Corymebacteriumsp.)[9]、 假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[10]、分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)[11]、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)[12]以及諾卡氏菌屬(Nocardiasp.)[13]等。作者選用篩選的分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)，根據(jù)已知的分枝桿菌的3-甾酮-Δ1-脫氫酶(kstD)堿基保守序列設(shè)計簡并引物，克隆獲得部分脫氫酶序列并通過染色體走讀獲得kstD全基因序列，并在大腸桿菌中進行表達，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因工程大腸桿菌。

1 實驗

1.1 菌株與質(zhì)粒

分枝桿菌(Mycobacteriumneoaurum) NwIB-01為脫氫酶基因的受體菌，自行從土壤中篩選得到；E.coliDH5α為克隆和表達的宿主菌。克隆/表達載體 pMD19-T、pUC18。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB液體培養(yǎng)基(%)：胰蛋白胨1，酵母提取物0.5，NaCl 1，pH值7.0。

MYC搖瓶培養(yǎng)基(g·L-1)：磷酸氫二鉀0.5，檸檬酸鐵銨0.05，檸檬酸2，甘油20，硫酸鎂0.5，硝酸銨2，碳酸鈣10，pH值5.8～6.5，攪拌5 min，滅菌后pH值7.5～7.8。

含質(zhì)粒的單克隆菌株接入含50 μg·mL-1Kanamycin或50 μg·mL-1Apramycin的2 mL LB培養(yǎng)基中，220 r·min-1、37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)過夜，4000 g離心收集菌體；較大規(guī)模的質(zhì)粒提取，培養(yǎng)基體積增加到50 mL，其余不變。

1.3 PCR擴增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過比較已經(jīng)被驗證功能的分枝桿菌1位脫氫酶基因，選擇Mycobacteriumsmegmatis和Mycobacteriumtuberculosis的1位脫氫酶基因序列，經(jīng)過對比，發(fā)現(xiàn)保守堿基序列，根據(jù)這一序列設(shè)計并合成簡并引物FZs和FZa：

FZs：GTGTTCTACATGACTGMYCAGGAG

FZa：TGCGGATYCCGCCCTTG

以FZs和FZa為引物對，以MycobacteriumneoaurumNwIB-01基因組DNA為模板進行PCR擴增(94 ℃ 1 min，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán))。提取氨芐青霉素(Amp)抗性平板上長出的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，分別用雙酶切驗證重組子質(zhì)粒中帶有片段大小。然后以經(jīng)過鑒定的重組子的質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，經(jīng)膠回收純化后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，篩選重組子經(jīng)EcoRI、HindⅢ雙酶切鑒定。M13正反向引物測序得到插入片段的DNA序列。

1.4 分枝桿菌基因組提取方法改進[14]

染色體走讀需要大量分枝桿菌基因組，而分枝桿菌的細胞壁堅韌，含有分枝酸，裂解困難，一般的裂解劑不易將結(jié)核分枝桿菌菌壁裂解。分枝桿菌DNA的制備方法有：酚氯仿抽提法、Triton法、SDS法、胰酶法、CTAB(N-Cetyl-N，N-trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)抽提法和酚抽提法，但這些方法在提取MycobacteriumneoaurumNwIB-01 DNA時效果并不好。因此，將以上方法加以改進：從培養(yǎng)了36 h的搖瓶中取3 mL分枝桿菌菌體置于管中，10 000 r·min-1離心1 min，去上清，將沉淀用3 mL 4%的NaOH溶液懸浮，置于37 ℃水浴振蕩30 min。10 000 r·min-1離心1 min，去上清。用去離子水洗滌2次，離心，去上清。

每管中加600 μL TE 緩沖溶液，沸水浴中加熱10 min，并立即將離心管放入-20 ℃冰箱，放置30 min；再于常溫下加入40 μL(20 mg·mL-1)溶菌酶，置于37 ℃水浴中振蕩120 min，加入蛋白酶K和SDS至終濃度分別為250 μg·mL-1和1%；提高水浴溫度至65 ℃，振蕩30 min；加入CETAB和NaCl 至終濃度為1%，置于水浴中20 min。隨后用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)沉淀蛋白質(zhì)，再用2 BV乙醇沉淀，離心得MycobacteriumneoaurumNwIB-01基因組。

1.5 分枝桿菌3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因全序列的獲得

為獲得3-甾酮-Δ1-脫氫酶序列片段上、下游序列，根據(jù)已經(jīng)得到的序列分別設(shè)計基因特異性引物Fzks1、Fzks2、Fzks3和Fzks4：

Fzks1：GTGTCTTTGACGTAGTGGTGGTAGGGAGC

Fzks2：CGGAGATGTTGTCGTTCGTGCTGAA

Fzks3：TCGTTGAGAAGGCTCCGCACTATGGC

Fzks4：CCATCGAACGGTTCAACGGTTTCGC

將MycobacteriumneoaurumNwIB-01基因組總DNA分別用粘性末端限制性內(nèi)切酶Sau3AI、EcoRI、HindⅢ和PstI消化后純化回收，在T4 DNA 連接酶作用下與相應步行接頭Sau3AI Cassette、EcoRI Cassette、HindⅢ Cassette和PstI Cassette 連接得到步行文庫。應用與分析kstD保守序列上、下游序列類似的方法得到DNA片段下游的序列。

1.6 Mycobacterium neoaurum NwIB-01 3-甾酮-Δ1-脫氫酶全長基因的克隆與表達載體構(gòu)建

根據(jù)MycobacteriumneoaurumNwIB-01 3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因的序列設(shè)計其全長引物Fzps和Fzpa：

以MycobacteriumneoaurumNwIB-01的基因組DNA為模板PCR擴增得到其全長基因。PCR擴增條件為：94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 120 s，30個循環(huán)。

采用MycobacteriumneoaurumNwIB-01 3-甾酮-Δ1-脫氫酶的全長引物Fzps、Fzpa，以MycobacteriumneoaurumNwIB-01基因組DNA為模板進行PCR擴增得到3-甾酮-Δ1-脫氫酶全長基因片段，此片段純化并用EcoRI 和HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切，膠回收雙酶切基因片段，與經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI 和HindⅢ雙酶切的pUC18載體在T4 DNA連接酶的作用下連接，得到質(zhì)粒pTQ002。對構(gòu)建好的pTQ002進行EcoRI 和HindⅢ雙酶切，PCR驗證。

1.7 3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因在 E.coli DH5α中的表達與酶活測定[15]

挑出經(jīng)雙酶切和PCR驗證過的E.coliDH5α轉(zhuǎn)化子，在一級種子50 mL LB液體培養(yǎng)基/Ampicillin中37 ℃培養(yǎng)過夜；再以1%的接種量接入50 mL LB液體培養(yǎng)基/Ampicillin中，37 ℃培養(yǎng)至菌體OD600為0.4時開始誘導，分別在誘導前IPTG終濃度為1 mmol·L-1和誘導14 h時取樣，進行SDS-PAGE電泳。

酶活檢測采用分光光度法。kstD的酶活檢測是通過測定600 nm處的光密度值，該值反映了2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)減少的情況。1 mL反應混合物由50 mmol·L-1的Tris-HCl(pH 值7.0)、40 μmol·L-1DCPIP、1.5 mmol·L-1吩嗪硫酸甲酯(PMS)、500 μmol·L-14-AD(溶于2%的甲醇)和適量的酶液組成，在30 ℃的水浴中保溫3 min。

酶活用mU表示，一個酶活單位(U)定義為1 min內(nèi)產(chǎn)生1 nmol DCPIP所需要的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 分枝桿菌3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因的PCR擴增、克隆以及序列分析

以簡并引物FZs和FZa為引物對，以MycobacteriumneoaurumNwIB-01基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到大小為1500 bp的片段，見圖1。

1.PCR Product with the primers FZs、FZa M.DNA Marker

該片段經(jīng)膠回收純化后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，并鑒定。M13正反向引物測序得到插入片段的DNA序列，NCBI Blastn(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比對，該片段與MycobacteriumgilvumPYR-GCK延胡索酸脫氫酶/琥珀酸鹽脫氫酶基因(Genbank CP000656)有84%同源性，與Mycobacteriumsmegmatisstr.MC2155的3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(Genbank CP000480)有83%同源性，與MycobacteriumvanbaaleniiPYR-1延胡索酸脫氫酶/琥珀酸鹽脫氫酶有82%的同源性，與Mycobacteriumavium104的3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(Genbank CP000479)有79%同源性。由此判斷該DNA片段是3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因的部分序列，同時也暗示該kstD有可能在TCA循環(huán)中發(fā)生作用。

2.2 分枝桿菌3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因全序列的獲得

按照1.4方法提取分枝桿菌基因組，如圖2所示。

1.The genomic DNA of Mycobacterium neoaurum NwIB-01 M.DNA Marker

通過染色體走讀，得到MycobacteriumneoaurumNwIB-01 3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因的全序列以及該片段后面的一段序列，比對后發(fā)現(xiàn)該片段與Mycobacteriumsmegmatisstr.MC2155 3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(Genbank CP000480)序列的部分同源性達到 82%，與Mycobacteriumavium104 3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(Genbank CP000479)同源性達到76%。

不同來源的kstD氨基酸序列比較見圖3。由圖3可知，3株菌的kstD在氨基酸序列開始的部分同源性相當高，而后續(xù)部分同源性較低。

M.s.=Mycobacterium smegmatis str.MC2155 M.sp.=Mycobacterium neoaurum NwIB-01 M.a.=Mycobacterium avium 104

MycobacteriumneoaurumNwIB-01 kstD氨基酸序列FAD的結(jié)合位點見圖4，方框位置為推測的FAD結(jié)合位點。

圖4 Mycobacterium neoaurum NwIB-01 kstD氨基酸序列FAD的結(jié)合位點

2.3 大腸桿菌表達載體的構(gòu)建及在E.coli DH5α中的表達

雙酶切基因片段與經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI 和HindⅢ雙酶切的pUC18載體在T4 DNA連接酶的作用下連接，得到質(zhì)粒pTQ002，見圖5。

圖5 pTQ002構(gòu)建過程圖

對pTQ002質(zhì)粒進行SDS-PAGE電泳，由于pUC18只有弱啟動子，產(chǎn)生的3-甾酮-Δ1-脫氫酶含量較低，無法從電泳圖譜看出。

2.4 E.coli DH5α中3-甾酮-Δ1-脫氫酶的酶活測定

按照1.7方法測得E.coliDH5α3-甾酮-Δ1-脫氫酶酶活為(0.37±0.05)U·mL-1，約為MycobacteriumneoaurumNwIB-01酶活的一半。

2.5 討論

由于分枝桿菌的3-甾酮-Δ1-脫氫酶(kstD)是一種膜蛋白酶，利用大腸桿菌高效表達系統(tǒng)表達單獨的膜蛋白，往往會使其在膜內(nèi)大量聚集而形成包涵體，載體pUC18的啟動子為弱啟動子，用pUC18作為載體表達的蛋白量比較少，不易形成包涵體，酶活較低，約為原酶活的一半。在后續(xù)的研究當中，可以考慮將分枝桿菌的3-甾酮-Δ1-脫氫酶的基因在鉛青鏈霉菌中表達，既可以提高酶量，也可以分泌到胞外表達，有望大幅提高酶活。

3 結(jié)論

通過分析已知兩種分枝桿菌的3-甾酮-Δ1-脫氫酶(kstD)堿基保守序列，設(shè)計簡并引物，以甾醇降解菌株MycobacteriumneoaurumNwIB-01的DNA作模板，得到一個kstD基因片段，通過染色體走讀得到其完整的閱讀框。以pUC18為異源表達載體，構(gòu)建pTQ002表達質(zhì)粒，在E.coliDH5α中對kstD進行了胞內(nèi)活性表達，測定MycobacteriumneoaurumNwIB-01 kstD 酶活為(0.37±0.05)U·mL-1，約為原酶活的一半，為構(gòu)建高效轉(zhuǎn)化生成3-酮基-1，4-二烯類固醇的基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。

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