楚 亮， 周 娟， 王 穎， 伍丕娥， 黎躍成

(四川省食品藥品檢驗所，四川成都610097)

人工牛黃收載于中國藥典2010年版一部，為批準文號管理，由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?；撬?、膽紅素、膽固醇、微量元素等組成，具有清熱，解毒，化痰，定驚的作用［1］。由于天然牛黃資源稀缺，價格昂貴［2］，人工牛黃為國內(nèi)大多數(shù)生產(chǎn)含牛黃制劑的廠家廣泛使用。當前中藥摻偽的現(xiàn)象時有發(fā)生，不法分子對一些資源少，價格高的藥材通過染色來改善藥材外觀［3］，以次充好，謀取利益。本實驗對偽品人工牛黃中添加的非法染色物質進行鑒定，并建立相關檢測方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD檢測器;Agilent 6210 TOF/MS質譜儀。

1.2 試劑 乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 對照品 胭脂紅(批號111771-200701)、金橙Ⅱ(批號 111769-200701)、金胺 O(批號 111770-200701)、酸性紅73(批號111773-200701)、赤蘚紅(批號111772-200701)，均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.4 化工染料 日落黃、新紅、誘惑紅、808猩紅、Scarlet等購于化工商店。

1.5 藥材樣品 偽品人工牛黃9批。

2 方法與結果

2.1 偽品人工牛黃中染色物質的薄層色譜檢查

2.1.1 對照品溶液的制備 取胭脂紅、日落黃、金橙Ⅱ、新紅、誘惑紅、金胺 O、scarlet、酸性紅73、赤蘚紅、808猩紅對照品及化工染料，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取9批偽品人工牛黃樣品各0.5 g，加甲醇 10 mL，超聲處理 20 min，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.1.3 試驗方法 吸取上述溶液各5～10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水(1∶3∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。

2.1.4 結果 5批偽品人工牛黃 B-1、Y-4、Y-5、B-3、H-4檢出與金胺O對應的黃色斑點并且可能含有scarlet或酸性紅73;1批偽品人工牛黃Y-2檢出與金胺O對應的黃色斑點、與金橙Ⅱ對應的橙色斑點、與胭脂紅對應的紅色斑點;1批偽品人工牛黃Y-6檢出與金胺O和胭脂紅對應的顏色斑點;2批偽品人工牛黃H-6、B-4檢出與金橙Ⅱ對應的顏色斑點，結果見圖1。

2.2 偽品人工牛黃中染色物質的HPLC-DAD驗證

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Lichrospher C18柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)。以甲醇為流動相 A，以0.005 mol/L醋酸銨為流動相B，按表1梯度進行試驗，檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長432 nm(金胺O)、484 nm(金橙Ⅱ)、508 nm(胭脂紅、scarlet、酸性紅73)。體積流量:0.6 mL/min。柱溫:35℃。

圖1 染色物質的薄層確定Fig.1 TLC chromatograms of Bovis Calculus artifactus and dyes

表1 人工牛黃中染色物質的HPLC-DAD流動相梯度表Tab.1 Gradient elution chart of HPLC-DAD

2.2.2 對照品溶液的制備 取金胺O試劑適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含50 μg的溶液;取金橙Ⅱ試劑適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含60 μg的溶液;取胭脂紅、scarlet、酸性紅73試劑適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 同2.1.2項。

2.2.4 測定法 分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖及200～700 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜圖。

2.2.5 結果 相應供試品色譜中，呈現(xiàn)與金胺O、金橙Ⅱ、胭脂紅對照品保留時間相同的色譜峰，相應色譜峰200～700 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜圖與金胺O、金橙Ⅱ、胭脂紅對照品一致，結果見圖2。供試品在26 min出現(xiàn)的色譜峰與scarlet、酸性紅73對照品保留時間一致，但紫外-可見吸收光譜有明顯差異。

2.3 偽品人工牛黃中染色物質的HPLC-MS驗證

2.3.1 質譜條件 色譜條件同2.2.1項，質譜檢測參數(shù)見表2。

2.3.2 結果 取2.1項下的對照品溶液和供試品溶液按照表2中質譜條件進行測定。

圖2 金胺O、胭脂紅、金橙Ⅱ、人工牛黃樣品色譜圖以及光譜圖Fig.2 HPLC chromatograms and UV spectras of auramine O，orange II，Ponceau 4R，Calculus bovis artifactus

表2 人工牛黃中染色物質的質譜檢測參數(shù)Tab.2 MS detection parameters

金胺O對照品主要色譜峰ESI+顯示m/z268［M+H］+，與金胺 O的準分子離子［C17H21N3+H］+質量相符，以準分子離子峰為母離子的二級質譜中出現(xiàn)有 m/z107.07、131.06、147.09、252.15 的碎片離子，金胺O染色樣品色譜與金胺O對照品相應色譜峰具有相同的質譜特征。

金橙II對照品主要色譜峰 ESIˉ顯示 m/z327［M-Na］－，與金橙 II的準分子離子［C16H11N2O4SNa］－質量相符，以準分子離子峰為母離子的二級質譜中出現(xiàn)有 m/z107.04、155.99、171.00 的碎片離子，金橙II染色樣品色譜與金橙II對照品相應色譜峰具有相同的質譜特征。

胭脂紅對照品主要色譜峰ESI+顯示m/z539［M+H］+，與胭脂紅的準分子離子［C20H14N2O10S3+H］+質量相符，以準分子離子峰為母離子的二級質譜中出現(xiàn)有 m/z457.01、473.01、496.99、520.98 的碎片離子，胭脂紅染色樣品色譜與胭脂紅對照品相應色譜峰具有相同的質譜特征。

3 結果

建立了偽品人工牛黃染色物質的檢測方法并進行檢測，5批偽品人工牛黃檢出金胺O;1批偽品人工牛黃檢出金胺O、金橙Ⅱ、胭脂紅;1批偽品人工牛黃檢出金胺O和胭脂紅;2批偽品人工牛黃檢出金橙Ⅱ。

4 討論

4.1 為確保結果的準確，對TLC檢測出色素的偽品人工牛黃進一步采用 HPLC-DAD、MS進行驗證［4］。通過以上鑒定可以確認偽品人工牛黃非法染色物質為金胺O、金橙Ⅱ和胭脂紅。色譜圖中保留時間為26 min的紅色素還有待進一步鑒定。金胺O(auramine 0)又名金胺、堿性嫩黃、金絲雀黃等［5］在國外已列為禁用染料，金橙Ⅱ(orange II)又稱酸性橙Ⅱ、酸性橙7、酸性金黃Ⅱ［6］是食品禁用色素，金橙Ⅱ具有腎臟毒性［3］和致癌性［7］。目前已有文獻報道在蒲黃、黃芩中檢測出金胺O，在紅花和丹參中檢測出金橙Ⅱ［8］。胭脂紅(ponceau 4R)又名胭脂蟲色素，據(jù)報道，胭脂紅對泥鰍紅細胞具有一定的致突變作用［9］。低、中劑量組胭脂紅會導致小鼠腎臟系數(shù)與陰性對照組相比有升高的趨勢［10］。胭脂紅收載于食品添加劑使用衛(wèi)生標準，標準對胭脂紅使用限量做出了規(guī)定，在后續(xù)研究中還應該增加胭脂紅的定量測定，確保用藥安全。

4.2 人工牛黃中膽紅素價格較高，本實驗同時對膽紅素的薄層鑒別進行了研究，結果偽品人工牛黃中均未檢出膽紅素斑點。此外，對9批樣品進行了熾灼殘渣測定，結果有6批樣品熾灼殘渣超過90%，對這6批樣品進行ICP-MS分析，結果顯示Fe、Al、Mg量極高，有待進一步研究。

4.3 人工牛黃為貴細藥，在中成藥中多以原粉入藥，為保證中成藥質量，應進一步加大對中藥材、中藥飲片的市場監(jiān)管，規(guī)范中藥市場秩序，保證人民群眾的用藥安全。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:5-8.

［2］黃海萍，譚桂山.人工牛黃中膽紅素研究進展［J］.中國藥事，2005，19(2):114.

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［6］肖義夫，顧萬江.高效液相色譜法同時測定食品中的金橙Ⅱ和蘇丹紅Ⅰ ～Ⅳ［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2007，34(8):1547-1549.

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