朱祥明，楊通漢，姚富柱，湯 戎，趙 楊，蘇品璨，羅 臻，涂源泉，郭 萍，姚 杰，李開紅

（昆明血液中心，云南 昆明 650106）

人類血小板同種抗原（human platelet alloantigen,HPA）是分布在血小板糖蛋白上一類特異性抗原，又稱血小板特異性抗原。由于HPA的不配合而產(chǎn)生的血小板抗體可以導致新生兒同種免疫血小板減少癥（NAITP）、輸血后紫癜（PTP）以及致血小板輸注無效（Platelet Transfusion Refractoriness,PTR），給患者帶來巨大的經(jīng)濟負擔，這是臨床和輸血領(lǐng)域共同遇到的重要問題[1-5]。

研究不同地區(qū)人群的HPA頻率，建立已知型地區(qū)性血小板獻血者資料庫，可大力解決因血小板同種免疫造成的血小板輸注無效及輸血后紫癜的難題，具有重要的臨床指導意義[6]。

作者對1000名無血緣關(guān)系的自愿無償單采血小板獻血者做HPA-1-17等位基因進行分析。獲取了昆明地區(qū)人群HPA-1-17基因頻率，建立了的已知型血小板獻血者基因數(shù)據(jù)庫，為解決昆明地區(qū)血小板同種免疫輸注難題及血小板同種免疫疾病診斷奠定了基礎(chǔ)[7-9]。

對象與方法

一、研究對象 1000名昆明地區(qū)無血緣關(guān)系固定無償單采血小板捐獻者，漢族，年齡18～50歲，每名志愿者采集外周靜脈血5ml。

二、試劑及儀器 5%EDTA-Na2，ST系列一次性真空采血管（北京批號：071020）；TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技，批號：H6820）；TaqDNA聚合酶（Roche公司，批號：06077E）；血小板同種抗原1-17基因分型檢測試劑盒（天津，批號：1001A）所用試劑均在有效期內(nèi)，嚴格按照操作說明書使用。超微量核酸測定儀 （Thermo Biomate3），9700PCR擴增儀（ABI公司），電泳儀（AB gene公司），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。DNA制備嚴格按照試劑說明書提取DNA，并采用核酸測定儀測定DNA濃度，并調(diào)定至 （50～150） ng/μl，純度A260/280=1.6-1.9。

三、基因分型（HPA1-17分型） 1.PCR擴增體系及條件 擴增體系每人份用量中包括：140μl濃縮dNTP-Buffer+180μl去離子水+3.3μl-Taq 酶(5U/μl)+50μl樣品DNA 共373.3.7μl混合液，分別向34個引物孔各加入上述混合液。擴增條件為：96℃，2min；96℃ 20s，70℃ 60s，8個循環(huán)；96℃ 20s，64℃ 50s，72℃ 45s，10個循環(huán)； 96℃20s，61℃ 50s，72℃45s擴增20個循環(huán)，最后72℃延伸5min。最后4℃保存。

2.凝膠電泳 PCR產(chǎn)物分析采用TBE緩沖液制備的3%瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色,150V電泳10分鐘后紫外燈下拍照記錄。

3.結(jié)果判斷 在紫外透射下，出現(xiàn)內(nèi)照帶表示PCR擴增成功，有特異擴增產(chǎn)物條帶的反應(yīng)為陽性。對照反應(yīng)格局圖，判定HPA1-17基因型。

4.統(tǒng)計學分析 HPA基因命名參照[10]。HPA采用方根法由表型頻率估計基因頻率[11]：抗原頻率（f）i=陽性抗原數(shù)/N，基因頻率(gf)=1－（fi為表型頻率，N為觀察數(shù)，gf為基因頻率）。HPA不配合率=(1-P)2×P(F為表型頻率)。基因型觀察值與期望值之間的吻合度采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。

結(jié) 果

經(jīng)PCR-SSP檢測，1000名血小板獻血者均得到HPA1-17抗原34個等位基因電泳結(jié)果，詳見表1-2，隨機選3個樣本，舉例如圖所示（見圖1、2、3）。

樣本1的基因型為：1a/1a，2a/2a，3a/3a，4a/4a，5a/5a，6a/6b，7a/7a,8a/8a,9a/9a,10a/10a,11a/11a,12a/12a,13a/13a,14a/14a,15a/15a,16a/16a,17a/17b

樣本2的基因型為：1a/1a,2a/2a,3a/3b,4a/4a,5a/5a,6a/6a,7a/7a,8a/8a,9a/9a,10a/10a,11a/11a,12a/12a,13a/13a,14a/14a,15a/15a,16a/16a,17a/17b

樣本3的基因型為：1a/1a,2a/2a,3a/3a,4a/4a,5a/5a,6a/6a,7a/7a,8a/8a,9a/9a,10a/10a,11a/11a,12a/12a,13a/13a,14a/14a,15a/15b,16a/16a,17a/17b

本次研究中，昆明地區(qū)漢族人群血小板獻血者HPA1-17基因和基因頻率見表4，每個樣本均檢測 到 HPA-1a， 2a， 4a-14a， 16a， 17a 基 因 ；HPA-4a，7a-14a，16a，17a呈現(xiàn)單態(tài)性，未檢測出相應(yīng)的等位基因HPA-b;對于HPA-1、-2、-5、-6主要以a/a純合子為多，a/a基因型頻率分別是0.989、0.96、0.99、0.98，沒有b/b純合子出現(xiàn)。在HPA1-17中，具有最高雜合度的是HPA-15，基因型HPA15a/15a，HPA15a/15b，HPA15b/15b 頻率分別是0.392、0.36、0.248；HPA-3在其次，基因型HPA3a/3a，HPA3a/3b，HPA3b/3b頻率分別是0.339、 0.467、 0.194。 經(jīng) χ2檢 驗 ， 結(jié) 果 符 合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（見表1）。

本次研究為國內(nèi)外類似報道中，首次完整地檢測了血小板獻血者HPA1-17基因遺傳多態(tài)性，與國內(nèi)外的一些HPA群體遺傳學部分數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學χ2檢驗，結(jié)果見表2。

討 論

血小板抗原具有高度多態(tài)性，它的多態(tài)性是由位于血小板糖蛋白上的單個堿基取代而導致相應(yīng)氨基酸的改變而產(chǎn)生的。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和對人類血小板抗原基因結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，使得血小板抗原的檢測方法由傳統(tǒng)的血清學方法發(fā)展為以DNA為基礎(chǔ)的HPA基因分型方法。本文采用PCR-SSP對昆明地區(qū)1000名自愿單采血小板獻血者進行HPA1-17系統(tǒng)進行了基因分型，結(jié)果提示了昆明地區(qū)獻血者HPA1-17基因型和等位基因頻率分布概況，為建立已知型血小板獻血者庫和血小板配合性輸注提供實驗依據(jù)。

HPA抗體雖不是引起血小板輸注無效的最主要免疫因素[21]，但是患者一旦產(chǎn)生抗HPA抗體，其所導致的血小板輸注無效將非常嚴重[22]。本次研究的HPA結(jié)果與國內(nèi)外不同地區(qū)及國家相比，基因頻率不盡相同（表2），其中HPA-3a系統(tǒng)與我國其他城市、亞洲國家和地區(qū)（日本、臺灣、泰國）相似，而與英國、美國人種有較大差異。HPA-15a系統(tǒng)頻率與重慶、廣州報道相似；而與青島、臺灣、英國、美國等地的報道有較大差異。本次調(diào)查結(jié)果再次證實HPA-3、15在中國漢族人群中具有較高遺傳多態(tài)性，在臨床輸血實踐中是最為重要血小板抗原系統(tǒng)。對HPA抗原作基因分型，在血小板同種免疫引起的NAITP，PTP以及PTR的診斷中，具有重要的臨床意義[23]。

本次研究表明昆明地區(qū)漢族血小板獻血者HPA1-17基因頻率與南方漢族接近，也呈現(xiàn)其自身的特點。隨著輸血技術(shù)的發(fā)展和成分輸血的普及，血小板減少癥患者接受單采血小板輸注，可減少出血的危險，有效提升血小板計數(shù)，單采血小板的輸注也逐漸被廣泛應(yīng)用于臨床。由于血小板輸注的局限性，目前臨床上輸注單采血小板時，仍采用隨機化的方法（即ABO血型相合性輸注，未經(jīng)血小板血型交叉配合相合） 輸注，因而可能被血小板同種抗原免疫致敏，主要產(chǎn)生抗HLA-Ⅰ和抗HPA。選擇HLA配合的血小板，或HLA及HPA都配合的血小板，是減少免疫性血小板輸注無效的較為理想的方法[24,25]。通過對某地區(qū)人群HPA的篩查，可掌握該區(qū)域人群中HPA基因型分布情況，為臨床上需要輸注血液或成分血的患者提供相匹配的血液制品，提高血小板輸注的安全性和有效性。本次調(diào)查的1000名的單采血小板獻血者HPA基因頻率,，經(jīng)分析符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，證明結(jié)果是可信的。據(jù)此建立的血小板獻血者基因庫，不僅可為昆明地區(qū)人群制定血小板同種免疫性疾病的篩選計劃提供根據(jù)，而且可為探索民族起源、遺傳、遷徙及法醫(yī)個體識別提供科學數(shù)據(jù)[26]。

表1 昆明地區(qū)單采血小板獻血者HPA1-17基因型和基因頻率分布

表2 昆明地區(qū)單采血小板獻血者HPA1-17基因分布特點與其它種族、地域間的群體比較

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