宋俊英，趙平鴿，余陳歡，吳巧鳳

(1.浙江義烏市中心醫(yī)院，浙江 義烏 322000;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

草烏為毛茛科植物北烏頭(Aconitum kusnezoffii Reichb.)的干燥塊根，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功能，用于風(fēng)寒濕痹、心腹冷痛等癥［1］，其主要成分為生物堿，其中烏頭堿為其有效成分及主要毒性成分［2-3］。浙貝母為百合科貝母屬植物浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)的干燥鱗莖，為“浙八味”之一，為江浙地區(qū)的道地藥材，具清熱潤(rùn)肺，化痰止咳及散結(jié)等功效，主要含有貝母甲素、貝母乙素等生物堿成分［4-5］。生草烏與浙貝母均為臨床常用中藥，但兩者有配伍禁忌，傳統(tǒng)中醫(yī)理論中有“半蔞貝蘞芨攻烏”之說，認(rèn)為烏頭類中藥(包括附子、烏頭、草烏)與貝母(浙貝母、川貝母)互為“相反”藥物，兩者藥物經(jīng)配伍應(yīng)用可增強(qiáng)藥物的毒副作用，歷代醫(yī)藥學(xué)家遵信者居多，并以此為戒，不敢越雷池半步。

但近幾年來，不斷有學(xué)者報(bào)道，在臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)這兩種藥物經(jīng)配伍使用后并未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用，且有相反相成的作用。李遠(yuǎn)實(shí)［6］報(bào)道，生草烏與浙貝母焙干研末醋調(diào)制成餅外用貼于內(nèi)關(guān)、期門二穴，可產(chǎn)生局部刺激作用，對(duì)頑呃有奇效;王為民［7］采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)烏頭反貝母進(jìn)行了化學(xué)配伍規(guī)律研究，結(jié)果表明烏頭配伍貝母后毒性增加幅度不大。但目前有關(guān)生草烏與浙貝母配伍的化學(xué)與藥理毒理研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，測(cè)定生草烏與浙貝母不同配比水煎液及其經(jīng)人工胃、腸液解離后的溶液中烏頭堿及烏頭堿水解產(chǎn)物焦烏頭堿、苯甲酰烏頭堿和苯甲酸含量的變化，闡明生草烏與浙貝母不同比例配伍后烏頭堿類毒性成分的變化規(guī)律和毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

生草烏(產(chǎn)地:四川安縣，批號(hào):090319)、浙貝母(產(chǎn)地:浙江磐安，批號(hào):080710)，均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)本校資源鑒定教研室俞冰副教授鑒定，分別為北烏頭 Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥塊根和浙貝母 Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鱗莖。

烏頭堿對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào):110720-200410)，中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙腈(色譜純，批號(hào):20100412)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;其他所用試劑均為分析純;

Waters 1525型高效液相色譜儀(配Waters 2998 PAD檢測(cè)器、Empower色譜工作站)，美國(guó)Waters公司;KQ-5200型超聲波清洗器(40 kHz，200 W)，昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈-醋酸銨緩沖液(pH 10.5)(60∶40)，流速:1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):240 nm，柱溫:28℃。理論板數(shù)按烏頭堿、焦烏頭堿、苯甲酰烏頭堿和苯甲酸峰計(jì)均不低于3 000。結(jié)果見圖1。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 草烏、貝母單煎液的制備 稱取生草烏、貝母各10 g，分別加20倍量水煎煮，冷卻后過濾，濃縮至10 mL，即得草烏及貝母單煎液。每1 mL煎液相當(dāng)于生藥1 g。

圖1 烏頭堿類成分及苯甲酸對(duì)照品(A)、草烏單煎液(B)的HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of Aconitine-type alkaloids and Benzoic acid(A)，the extraction of A.Kusnezoffii(B)

2.2.2 草烏貝母不同配比合煎液的制備 分別稱取生草烏5 g和貝母5 g、生草烏5 g和貝母10 g、生草烏10 g和貝母5 g，分別加20倍量水煎煮，冷卻后過濾，濃縮至10 mL，即得草烏貝母3種配比(1∶1、1∶2、2∶1)的合煎液。

2.2.3 草烏、貝母單煎后混合液的制備 取2.2.1項(xiàng)下草烏和貝母單煎液，分別按生藥量1∶1、1∶2和2∶1混合，即得草烏貝母 3 種配比(1∶1、1∶2、2∶1)的單煎后混合液。

2.2.4 草烏貝母合煎液的人工消化處理 分別取草烏貝母不同配比合煎液5 mL，加入人工胃液或人工腸液(按中國(guó)藥典2005年版一部附錄ⅫA制備)100 mL，模擬人體內(nèi)消化環(huán)境，于37℃恒溫水浴振蕩處理1 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液，濃縮至10 mL。

2.3 烏頭堿及其水解產(chǎn)物的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 參考《中國(guó)藥典2010版》和文獻(xiàn)報(bào)道［8］，根據(jù)烏頭堿水解的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)原理，制備其不同的水解產(chǎn)物。

2.3.1.1 焦烏頭堿的制備 取烏頭堿對(duì)照品1.9 mg，滴入微量甲醇并超聲使其溶解，加入水適量，用微孔濾膜將其濾過于5 mL量瓶中，加水至刻度，得水解前原溶液，50℃恒溫箱中放置30 min，取出立即放置冰水浴中終止其水解反應(yīng)，即得焦烏頭堿對(duì)照品溶液。焦烏頭堿濃度以原溶液中烏頭堿的摩爾濃度進(jìn)行折算。

2.3.1.2 苯甲酰烏頭堿和苯甲酸的制備 取烏頭堿0.95 mg，滴入微量甲醇并超聲使溶，加水適量，用微孔濾膜濾過，置5 mL量瓶中，加水至刻度，制得水解前原液，置120℃烘箱處理后，得水解后溶液，即苯甲酰烏頭堿和苯甲酸溶液。苯甲酰烏頭堿和苯甲酸濃度以原溶液中烏頭堿的摩爾濃度進(jìn)行折算。

2.3.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密取烏頭堿對(duì)照品溶液、焦烏頭堿對(duì)照品溶液、苯甲酰烏頭堿對(duì)照品溶液適量，并精密稱取苯甲酸對(duì)照品適量，置同一5 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得烏頭堿、焦烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酸濃度分別為0.057，0.044，0.044 和0.032 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3.2 線性關(guān)系的考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液 2.5，5，10，15，20 μL，分別注入液相色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，含量(X，μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程分別為:烏頭堿:Y=790 995 X+2 804，r=0.999 9;焦烏頭堿:Y=444 064 X+168，r=0.999 7;苯甲酰烏頭堿:Y=503 012 X+11 080，r=0.999 6;苯甲酸:Y=101 941 X+1 540，線性范圍依次為 0.14 ～1.14，0.12 ～0.92，0.11 ～0.89，0.079 ～0.63 μg。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣5次，每次10 μL，結(jié)果烏頭堿、焦烏頭堿、苯甲酰烏頭堿和苯甲酸峰面積的 RSD值分別為0.51%，2.89%，2.31%和 0.82%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取草烏貝母(1∶1)合煎供試品溶液，分別在 0，2，4，8，12 和 24 h 進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果烏頭堿、焦烏頭堿、苯甲酰烏頭堿和苯甲酸峰面積的 RSD 分別為 2.27%，2.84%，2.12%和1.66%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取草烏貝母(1∶1)合煎液，平行制備供試品溶液5份，測(cè)定峰面積，結(jié)果烏頭堿、焦烏頭堿、苯甲酰烏頭堿和苯甲酸峰面積的RSD分別為 2.11%，3.24%，1.16%和 0.97%，表明重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 平行吸取已知烏頭堿類成分含量的草烏貝母(1∶1)合煎液5份，加入等量的對(duì)照品混合溶液，平行制備供試品溶液，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，并求回收率。結(jié)果烏頭堿、焦烏頭堿、苯甲酰烏頭堿和苯甲酸的平均回收率分別為99.7%，100.9%，99.5% 和 97.6%，RSD(n=5)分別為 2.11%，3.24%，1.16%和 0.97%。

2.4 樣品含量測(cè)定

分別取2.2項(xiàng)下制備的溶液，適當(dāng)稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，其中，總生物堿含量為樣品中烏頭堿、焦烏頭堿和苯甲酰烏頭堿含量之和。由于各配伍液中草烏所占比例各不相同，為便于橫向比較草烏貝母不同配伍比例條件下貝母對(duì)草烏中烏頭堿及其水解產(chǎn)物含量的影響，故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果按草烏的投藥量進(jìn)行折算，以統(tǒng)一不同配比對(duì)草烏中烏頭堿類成分含量變化的影響。結(jié)果見表1。

表1 草烏貝母配伍后各烏頭堿及其水解成分含量的變化Tab.1 The contents of aconitine and its hydrolysate in extractions prepared with A.Kusnezoffii and F.thunbergii in different ratios

3 討論

烏頭類藥材中主要含有烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型二萜類生物堿。這些成分既是藥效成分，也是毒性成分，在一定條件下可部分水解為單酯型生物堿，毒性大為降低，繼續(xù)水解則進(jìn)一步變?yōu)榘反碱惿飰A，毒性更?。?］。本研究采用HPLC法測(cè)定了草烏中雙酯型烏頭類生物堿烏頭堿及其兩種水解產(chǎn)物的含量，克服了以往研究對(duì)該類藥物僅測(cè)定含量只占極少數(shù)的原型(雙酯型)生物堿的弊端，為含有草烏、附子等以及烏頭類生物堿為主要藥效成分的一大類中藥制劑提供了更加科學(xué)的質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。但在本實(shí)驗(yàn)中僅檢測(cè)到烏頭堿及其水解產(chǎn)物，未檢測(cè)到新烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型二萜類生物堿，這可能與實(shí)驗(yàn)所選藥材品種有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，以烏頭堿、焦烏頭堿、苯甲酰烏頭堿及苯甲酸為含量測(cè)定對(duì)象，比較草烏與貝母不同配比在煎煮過程及體外模擬消化環(huán)境中烏頭堿類成分的含量變化。由表1可知，除草烏貝母(2∶1)合煎液外，草烏貝母不同配比合煎或單煎后混合液中烏頭堿的含量較草烏單煎液明顯提高，其中以草烏貝母單煎混合后的溶液中烏頭堿及其水解產(chǎn)物的含量最高?？梢?，草烏貝母配伍后可增加合煎或單煎后混合液中烏頭堿類生物堿的含量，證實(shí)了“草烏反貝母”的科學(xué)性。

據(jù)報(bào)道［10］，烏頭堿在高溫或酸性條件下可水解生成苯甲酰烏頭堿和苯甲酸。由于苯甲酸具有一定的揮發(fā)性，因此在草烏單煎液中僅檢出少量苯甲酸，而在草烏貝母合煎液中未檢出;然而草烏貝母單煎后的混合液中卻含有大量的苯甲酸，其含量高于草烏單煎液，但烏頭堿的含量卻不減反增，這進(jìn)一步證實(shí)了“草烏反貝母”的科學(xué)性。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，草烏貝母不同配比中，無論是烏頭堿及其水解產(chǎn)物，還是總生物堿，均以草烏貝母1∶1配伍后含量最高。經(jīng)人工胃、腸液處理后，各樣品溶液中烏頭堿、焦烏頭堿及苯甲酰烏頭堿的含量顯著降低，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，各樣品溶液中烏頭堿、焦烏頭堿及苯甲酰烏頭堿的構(gòu)成比也明顯變化，草烏貝母1∶1合煎液中三者的構(gòu)成比為1∶9∶21，而經(jīng)人工胃液處理后為1∶128∶63，人工腸液處理后為1∶15∶44，證明人工胃、腸液(特別是人工腸液)一方面可降低溶液中烏頭堿類成分的含量，同時(shí)也可促進(jìn)烏頭堿的解離從而影響草烏發(fā)揮毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。但即使是總生物堿含量最高的草烏貝母(1∶1)合煎經(jīng)胃液處理后，按生草烏臨床劑量3 g折算，其烏頭類成分小鼠口服給藥量為0.26 mg/kg，遠(yuǎn)低于研究報(bào)道的1.8 mg/kg半數(shù)致死量［11］。因此，“草烏反貝母”是在一定條件下的配伍禁忌，還與其給藥量和給藥途徑有關(guān)。

中藥成分復(fù)雜，配伍出現(xiàn)相反，有可能是有新的有毒物質(zhì)產(chǎn)生或有毒物質(zhì)含量增高，或者是活性成分藥效抵消等情況［9-10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為草烏與貝母的配伍應(yīng)用提供可靠依據(jù)，從有毒化學(xué)成分含量變化的角度證實(shí)了“草烏反貝母”的科學(xué)性。

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