馮秀珍，丁燕飛，丁勁松，姚 瑤

(1.中南大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013;2.湖南省常德市藥品檢驗(yàn)所，湖南 常德 415000)

輔酶Q10是廣泛存在于各類細(xì)胞中的脂溶性類維生素物質(zhì)，是人體內(nèi)不可缺少的內(nèi)源性物質(zhì)，臨床上廣泛應(yīng)用于心肌梗死、慢性或充血性心力衰竭、高血壓、糖尿病、帕金森病、癌癥及艾滋病等的輔助治療［1］。輔酶Q10凍干乳劑是可供注射用的新劑型，具有載藥量大、穩(wěn)定、便于貯存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)［2-4］。本實(shí)驗(yàn)建立測(cè)定大鼠體內(nèi)輔酶Q10血藥濃度方法，并對(duì)輔酶Q10凍干乳在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)作初步研究。

1 材料

輔酶Q10對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):611-200102);輔酶Q10凍干乳(中南大學(xué)藥劑教研室制備);維生素K1(安徽萬(wàn)和制藥有限公司);無(wú)水乙醇、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

SHIMADZU LC-2010AHT型高效液相色譜儀、UV/Vis檢測(cè)器、Lc-solution工作站(日本島津)。

Wastar大鼠，雄性，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào):SCXK(滬)2007-005。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil BDS C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 － 無(wú)水乙醇(30∶70);柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm;進(jìn)樣量:20μL。內(nèi)標(biāo)為含約1.5μg/mL維生素K1的無(wú)水乙醇溶液。

2.2 給藥方案及大鼠血樣采集

取健康成年Wastar大鼠12只，雄性，隨機(jī)分配成2組(凍干乳組、空白組)，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，按0.8mg/kg劑量尾靜脈注射給藥，于給藥前和給藥后0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，12，24 h眼眶靜脈取血約250μL，3 000 r/min離心2 min，取血漿于－20℃保存。每取4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血樣，灌胃給予大鼠生理鹽水2mL，以保持血容量。

2.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取輔酶Q10對(duì)照品9.87mg，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至100mL，得對(duì)照品貯備液。再用無(wú)水乙醇稀釋成含輔酶 Q100.17，0.33，0.67，1.34，2.68，5.36，10.73和21.46 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4 血漿樣品處理

取血漿100μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液50μL，30℃水浴吹干，加萃取液［正已烷-無(wú)水乙醇(8∶1)混合液］4mL，渦旋混合60 s后2 000 r/min離心5 min，吸取上層萃取液3.0mL于離心管中，置30℃水浴上吹干，加無(wú)水乙醇100μL溶解即得。

2.5 方法專屬性

取2.4項(xiàng)下處理好的空白大鼠血漿樣品、空白大鼠血漿加對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)樣品、給藥后的大鼠血漿樣品以及含對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明輔酶Q10及內(nèi)標(biāo)與血漿中雜質(zhì)分離良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.6 線性范圍和定量下限

分別取輔酶Q10系列標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，加入空白血漿100μL后，按2.4項(xiàng)下自加入內(nèi)標(biāo)起操作并進(jìn)樣，以輔酶Q10峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比R為縱坐標(biāo)，輔酶Q10濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:R=1.365 7 C+0.029 4(r=0.999 8，n=6)。最低定量濃度為0.17 μg/mL，RSD(n=6)為5.35%。

2.7 萃取回收率

分 別取2.3項(xiàng)下含輔酶Q105.3 6，1.34，0.33μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液各5份，每份取100 μL，加入空白血漿100μL后，按2.4項(xiàng)下自加入內(nèi)標(biāo)起操作;同時(shí)取上述相同濃度輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)溶液加入內(nèi)標(biāo)溶液，不經(jīng)萃取直接氮?dú)獯蹈?，用前?00μL無(wú)水乙醇溶解。分別進(jìn)樣，計(jì)算輔酶Q10與內(nèi)標(biāo)的回收率。3種濃度血漿樣品輔酶Q10的萃取回收率分別為:(92.09±2.59)%，(89.39±2.38)%，(93.80±1.46)%(n=5);內(nèi)標(biāo)的萃取回收率分別為(93.27±1.41)%，(94.56± 2.69)%，(95.16± 1.42)%(n=5)。結(jié)果表明輔酶Q10與內(nèi)標(biāo)萃取回收率較高且差別不大，符合血樣測(cè)定要求。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.8 方法回收率和精密度

取含輔酶 Q105.36，1.34，0.33 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入空白血漿100μL后，按2.4項(xiàng)下自加入內(nèi)標(biāo)起同法操作，每個(gè)濃度各配制5份，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算回收率及日內(nèi)、日間精密度。3種濃度血漿樣品輔酶Q10的回收率分別為:(102.0±8.86)%，(102.6±5.28)%和(97.8±3.79)%(n=5)，方法精密度見(jiàn)表1。

2.9 穩(wěn)定性考察

將含輔酶 Q105.36，1.34，0.33 μg/mL 的血樣于－20℃放置，冷凍-融化循環(huán)3次，實(shí)驗(yàn)中均無(wú)明顯降解。將3種濃度的輔酶Q10血樣配制后放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。將3種濃度的輔酶Q10血樣－20℃放置10 d后，輔酶Q10濃度變化不大，濃度測(cè)定結(jié)果的RSD均小于7%。

表1 精密度測(cè)定結(jié)果(n=5)Tab.1 Result of intra-day and inter-day precision(n=5)

圖2 注射給藥后輔酶Q10平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of CoQ10 in rats after iv coenzyme Q10 in lyophilized emulsion

2.10 血漿樣品測(cè)定及初步藥動(dòng)學(xué)測(cè)定結(jié)果

12只大鼠按2.2項(xiàng)下給藥及采集血樣后，再按2.4項(xiàng)下處理，進(jìn)樣分析，測(cè)得平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。

血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)利用DAS 2.1.1版藥動(dòng)學(xué)分析軟件處理。結(jié)果表明，靜注輔酶Q10凍干乳后輔酶Q10在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為符合二室開(kāi)放模型。求得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如下:t1/2α為(0.15±0.04)h，t1/2β為(6.31±2.84)h，K10為(0.84±0.15)h－1，K12為(3.90± 1.83)h－1，K21為(0.39± 0.65)h－1，AUC0－24為(22.80±5.42)(μg·h)/mL，AUC0－∞為(26.82±6.70)(μg·h)/mL。

3 討論

6只空白大鼠與制劑同時(shí)間點(diǎn)取樣，同法測(cè)定各取樣時(shí)間點(diǎn)內(nèi)源性輔酶Q10濃度，在各時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)出明顯內(nèi)源性輔酶Q10。大鼠血漿中主要含輔酶Q9［5］，空白內(nèi)源性輔酶Q10的量本實(shí)驗(yàn)方法靈敏度范圍內(nèi)未檢出，因此實(shí)驗(yàn)中未考慮內(nèi)源性輔酶Q10的影響。

有報(bào)道，萃取時(shí)分別加入無(wú)水乙醇及正已烷，然后進(jìn)行萃取操作［5］，本實(shí)驗(yàn)將無(wú)水乙醇及正已烷按比例混合后一次加入，減少操作步驟，同時(shí)經(jīng)比較兩種方法測(cè)定結(jié)果沒(méi)有明顯差異。

選用正已烷-無(wú)水乙醇為萃取溶劑［6］，考察了不同比例(5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10∶1，11∶1，12∶1)的萃取效果。結(jié)果表明，無(wú)水乙醇比例增加，萃取效率提高，但乳化嚴(yán)重，管壁上固體物多，正已烷層與醇水混合層界面不清晰。當(dāng)大于9∶1時(shí)，萃取效率急劇下降，8∶1時(shí)萃取效率最高，油水界面最清晰，不發(fā)生乳化。因此選擇正已烷-無(wú)水乙醇(8∶1)為萃取溶劑。

文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定輔酶Q10血樣時(shí)采用輔酶Q9作為內(nèi)標(biāo)［7］，因大鼠血中含內(nèi)源性輔酶Q9，干擾測(cè)定，我們選用維生素K1作為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定結(jié)果良好，內(nèi)標(biāo)放置穩(wěn)定，處理過(guò)程中不降解。

由于輔酶Q10脂溶性強(qiáng)、乳劑可被動(dòng)靶向于含巨噬細(xì)胞豐富的組織如肝、脾、淋巴等器官，因此輔酶Q10凍干乳注射給藥后快速分配，t1/2α較小。

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