楊慧芳

心肌細胞內(nèi)向整流鉀電流Kir主要參與心肌細胞動作電位的4級靜息電位過程，與心肌細胞動作電位時程(APD)和有效不應(yīng)期(ERP)的長短密切相關(guān)，對維持心肌細胞正常生理功能有重要的作用，IK的異常也常常是心律失常的因素之一［1］。IK主要維持心肌細胞的靜息膜電位，是動作電位的重要組成部分，是維持心室肌細胞正常功能活動的重要電流。本文研究小鼠心肌細胞內(nèi)向整流鉀電流Kir2.1的在靜息膜電位中的參與與在所有內(nèi)向整流鉀電流中所占比例。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 豚鼠8只，體重200～250 g。本實驗中豚鼠由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2 試劑與溶液

1.2.1 試劑:Ⅱ型膠原酶(collagenase typeⅡ)為 GIBCO公司生產(chǎn)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 溶液:①無鈣臺氏液:NaCl 137.7 mmol/L，NaOH 2.3 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl 21 mmol/L，N-(乙羥乙基)哌嗪-N-2乙烷磺酸(HEPES)5 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L(用NaOH調(diào) pH 值 至 7.4);②KB 液:KCl 83 mmol/L，K2HPO430 mmol/L，MgSO45 mmol/L，KOH 2 mmol/L，丙 酮 酸 鈉5 mmol/L，牛 磺 酸 20 mmol/L，葡 萄 糖 10 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，HEPES 5 mmol/L，(用 KOH 調(diào) pH 值至 7.2);③記錄Kir2.1的電極內(nèi)液;④記錄 Kir的電極外液:NaCl 150 mmol/L，KCl10 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl25.4 mmol/L，用NaOH調(diào)pH值至7.4。

1.3 儀器 膜片鉗放大器Axon 200B為美國Axon公司產(chǎn)品;電極拉制器和三位操縱器均為Sutter公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡TE2000-S為Nikon公司產(chǎn)品。

1.4 方法 豚鼠心肌細胞的急性分離:將豚鼠麻醉后快速開胸取出心臟，至于冰無鈣臺式液中進行主動脈插管，連于Langendorff灌流裝置上，進行恒壓恒溫逆行灌流。灌流液溫度37℃，流速7 ml/min，用前用100%O2飽和。先用無鈣臺氏液灌流5 min，沖洗心臟中殘留的血液，然后灌以含12 mg/mlⅡ型膠原酶的無鈣臺氏液，循環(huán)灌流心臟1 520 min，之后再用無鈣臺氏液灌流，以沖洗心臟中殘留的膠原酶。將消化后的心肌剪下，置于KB液中剪碎，輕輕吹打至細胞分散。待細胞沉降后置換KB液，室溫下靜置1 h后用于膜片鉗記錄。

1.5 膜片鉗記錄 實驗采用標準全細胞膜片鉗方法記錄心肌細胞Kir2.1電流。將部分靜置的細胞放入浴槽中，待細胞貼壁后灌以外液。應(yīng)用電極拉制儀將薄細毛坯電極拉制成應(yīng)用電極并拋光待用。將電極接觸與細胞表面給予一定負壓，在細胞膜表面與電極尖之間形成緊密的封接，達GΩ。施加更大的負壓使細胞膜破膜，補償電極電容和串聯(lián)電阻，達到全細胞記錄模式(whole-cell recording)。記錄豚鼠心室肌細胞Kir2.1電流，并給予500 mmol/L BaCl2溶液，觀察與記錄Kir2.1的變化，并統(tǒng)計Kir2.1在心肌細胞內(nèi)向整流鉀離子電流中所占比例。

1.6 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用Clampfit 9.0(美國Axon公司)和Origin 7.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ba2+對IKir2.1的作用 應(yīng)用全細胞膜片鉗記錄Ba2+對豚鼠心肌細胞中Kir2.1的作用。全細胞記錄Kir2.1的protocol是采用牽制電壓為－120 mV逐漸升至40 mV再回到－120 mV。IK的電壓依賴性研究應(yīng)用牽制在－80 mV，再階躍到80 mV，再回到 －80 mV，依次從80 mV以10 mV降低至－30 mV。記錄到IKir2.1明顯被抑制，抑制率為(81±7)%。見圖1。

2.2 Ba2+抑制豚鼠心肌細胞Kir2.1的統(tǒng)計 見圖2。

圖1 500 mmol/L的Ba2+對Kir2.1 的作用

圖2 Ba2+抑制豚鼠心肌細胞統(tǒng)計圖

3 討論

Kir2.1主要分布于心肌細胞，對維持心肌細胞的靜息電位以及心肌復(fù)極過程起著重要的作用。其異常是導致心律失常的重要機制之一，同時也是導致其他器官異常的重要因素，例如它參與帕金森病形成等［1］，國內(nèi)外研究人員對于Kir2.1的調(diào)節(jié)機制研究已經(jīng)有很多的基礎(chǔ)。對于心肌細胞內(nèi)向整流鉀電流中Kir2.1所占比例，有諸多的研究［2］。心肌細胞的內(nèi)向整流鉀離子電流由多種鉀離子電流組成，心肌細胞的內(nèi)向整流鉀離子電流由多種鉀離子電流組成，在心臟的生理活動中起舉足輕生的作用［3－5］，本文主要研究Kir2.1對豚鼠心肌細胞內(nèi)向整流鉀離子組成的貢獻。通過實驗研究，我們發(fā)現(xiàn)Kir2.1在豚鼠心肌細胞中所占比例，即被Ba抑制的電流比例，為(81±7)%。說明Kir2.1是心肌細胞內(nèi)向整流鉀離子電流的主要組成部分，并且還有其他的電流組成部分，他們在維持心肌細胞的正常生理功能方面起著重要作用。

1 Regina PM，Günter S，Tobias G，et al.Heteromerzation of Kir2.x potassium channels contributes to the phenotype of Andersen’s syndrome.Physiology，2002，99:7774-7779.

2 GX Liu，C Derst，G Schlichthrl，et al.Comparison of cloned Kir2 channels with native inward rectifier K+channels from.Physiol，2001，532:115-126.

3 Jongsma HJ，Wilders R.Channelopathies:Kir2.1 mutations jeopardize many cell functions.Curr Biol，2001，11:R747-750.

4 Abraham MR，Jahangir A，Alekseev AE，et al.Channelopathies of inwardly rectifying potassium channels.FASEB J，1999，13:1901-1910.

5 He Y，Pan Q，Li J，et al.Kir2.3 knock-down decreases IK1 current in neonatal rat cardiomyocytes.FEBS Letters，2008，582:2338-2342.