楊 柳 ，王 萌 ，于 躍 ，郭秀英 ，閻 嘉 ，楊鳳蕊 ，孟 林

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，天津300070；2.北京市天壇生物制品股份有限公司，北京100024）

東北鶴虱（Lappula Echinata Gilib，LEG）為紫草科植物東北鶴虱的果實(shí)，盛產(chǎn)于我國(guó)華北、東北等地區(qū)。藥書記載，其味苦、辛、平，入脾、胃、肝三經(jīng)，可治療蟲積腹痛[1]，民間用其果實(shí)或全草水煎治療各種腹疼、腹瀉，尤其對(duì)慢性、遷延性腹瀉有獨(dú)到的療效。已有研究證明其多糖具有抗炎[2]、緩解平滑肌痙攣[3]、調(diào)節(jié)胃腸水平衡[4]等作用，也有實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)機(jī)體淋巴細(xì)胞功能有增強(qiáng)或調(diào)節(jié)作用[5]。本文將通過(guò)觀察巨噬細(xì)胞（MΦ）體外吞噬、細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的分泌，探討LEGPS-Ⅱ?qū)Φ參與免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 東北鶴虱多糖LEGPS-Ⅱ，淡黃色粉末，易溶于水，純度為38.7%。藥物用PBS緩沖液配制成1 mg·mL-1儲(chǔ)備液，-20℃冰箱保存，臨用前用PBS緩沖液稀釋成所需濃度。

1.1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液，北京天潤(rùn)善達(dá)生物科技有限公司；超級(jí)新生牛血清，美國(guó)Gibco公司；注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：05091008；四甲基偶氮唑鹽（Methyl thiazolyl tetrazole，MTT），瑞士 Fluka 公司；中性紅試劑，中奧天元科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 近交系清潔級(jí)BALB/C及昆明種小鼠，體重（20±0.25）g，4～5 周齡，雌雄不拘，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所（批準(zhǔn)文號(hào)：SCXK津2005-0001）。L929細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.4 儀器 Model 680型酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；CK40生物倒置顯微鏡（Olympus）；Forma SeriesⅡ型二氧化碳孵箱（Thermo Electron Corporation）

1.2 方法

1.2.1 LEGPS-Ⅱ?qū)γ庖咭种菩∈蟾骨籑Φ吞噬功能的影響 取昆明種小鼠1只，腹腔注射環(huán)磷酰胺，每次給藥劑量為25 mg·kg-1，連續(xù)給藥3 d。第3天給藥30 min后，將小鼠脫臼處死。無(wú)菌條件下常規(guī)方法制備腹腔MΦ懸液。另取同窩昆明種小鼠1只制備正常小鼠腹腔MΦ懸液，1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×106mL-1。實(shí)驗(yàn)分為正?？瞻讓?duì)照組（1640培養(yǎng)液200 μL）、免疫抑制組（1640培養(yǎng)液200 μL）、LEGPS-Ⅱ單獨(dú)刺激組（1640培養(yǎng)液180 μL 和 0.25～0.03125 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20 μL）、LEGPS-Ⅱ聯(lián)合ConA刺激組（1640培養(yǎng)液160 μL 和 0.25～0.03125 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20 μL 以及 5 μg·mL-1ConA 20 μL）、ConA 單獨(dú)刺激組（1640培養(yǎng)液 180μL和5μg·mL-1ConA 20 μL）。孵育 24 h后，吸去各孔上清液，PBS洗掉孔中非粘附細(xì)胞，然后加入0.072%的中性紅溶液100 μL，孵育4 h。倒置顯微鏡下觀察染色情況。后吸棄上清，用PBS洗掉各孔中未進(jìn)入細(xì)胞的中性紅，反復(fù)兩次。各孔中加入細(xì)胞裂解液100 μL，振蕩200 s后測(cè)OD570nm值。

1.2.2 LEGPS-Ⅱ?qū)γ庖咭种菩∈蟾骨籑Φ體外分泌IL-1β的影響 取昆明種小鼠同1.2.1的方法建立免疫抑制小鼠模型，并于無(wú)菌條件下收集免疫抑制小鼠腹腔MΦ懸液。另取同窩昆明種小鼠，同1.2.1的方法制備正常小鼠腹腔MΦ懸液，用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106mL-1。實(shí)驗(yàn)分組同上，其中 LEGPS-Ⅱ單獨(dú)刺激組 80～20 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20 μL、LEGPS-Ⅱ聯(lián)合 ConA 刺激組為80～20 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20 μL 以及 5 μg·mL-1ConA 20 μL。孵育48 h，此各孔上清液中即含IL-1β。另取BALB/c小鼠1只脫椎處死，無(wú)菌取胸腺，研磨過(guò)200目篩網(wǎng)，洗2次，得胸腺單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞密度為2.2×106mL-1，混勻，于96孔板中加入100 μL胸腺細(xì)胞懸液。將前述含有IL-1β的待測(cè)巨噬細(xì)胞上清液以每孔100 μL按對(duì)應(yīng)位置加入到此96孔板胸腺細(xì)胞懸液中，孵育48 h。以MTT法測(cè)570nm的吸光度值。

1.2.3 LEGPS-Ⅱ?qū)γ庖咭种菩∈蟾骨籑Ф體外分泌TNF-α的影響 取昆明種小鼠同1.2.1的方法建立免疫抑制小鼠模型，并于無(wú)菌條件下收集免疫抑制小鼠腹腔MΦ懸液。另取同窩昆明種小鼠，同1.2.1的方法制備正常小鼠腹腔MΦ懸液，用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106mL-1。實(shí)驗(yàn)分組同前，其中 LEGPS-Ⅱ單獨(dú)刺激組80～10μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20μL、LEGPS-Ⅱ聯(lián)合 ConA 刺激組 80～10 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ20μL以及5μg·mL-1ConA20μL。消化、收集L929細(xì)胞，加腹腔MΦ培養(yǎng)上清液并以MTT法測(cè)570 nm的吸光度值，計(jì)算抑制率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以±s形式表示。多樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 LEGPS-Ⅱ?qū)γ庖咭种菩∈蟾骨籑Φ吞噬功能的影響 在圖1中，正?？瞻讓?duì)照組的OD值高于免疫抑制組2倍以上，提示免疫抑制小鼠MΦ吞噬能力明顯低于正常小鼠，造模成功。結(jié)果也顯示，單獨(dú)使用 LEGPS-Ⅱ，在 0.03125~0.25 μg·mL-1范圍內(nèi)，MΦ吞噬能力較免疫抑制組提高，但低于ConA單獨(dú)刺激組和正?？瞻讓?duì)照組；同樣劑量范圍LEGPS-Ⅱ聯(lián)合ConA，吞噬能力也較免疫抑制組提高，但仍低于ConA單獨(dú)刺激組和正常空白對(duì)照組。

圖1 LEGPS-Ⅱ?qū)γ庖咭种菩∈蟾骨籑Ф吞噬功能的影響(±s,n=6)Fig1 EffectsofLEGPS-Ⅱonphagocytosisofperitonealmacrophage in immunosuppressive mice(±s,n=6)

2.2 LEGPS-Ⅱ?qū)γ庖咭种菩∈蟾骨籑Φ體外分泌IL-1β的影響 被環(huán)磷酰胺免疫抑制后的巨噬細(xì)胞處于靜止期，幾乎不再分泌細(xì)胞因子IL-1β。從圖2中可以看到，受免疫抑制組上清液中缺乏IL-1β的影響，其OD值較正?？瞻讓?duì)照組明顯降低，提示免疫抑制小鼠動(dòng)物模型建立成功；4個(gè)LEGPS-Ⅱ單獨(dú)刺激組對(duì)免疫抑制下的MΦ分泌IL-1β無(wú)明顯增加作用，與免疫抑制組的OD值相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。經(jīng)由ConA誘導(dǎo)后，免疫抑制下的MΦ可再次分泌IL-1β，ConA單獨(dú)刺激組的OD值達(dá)到免疫抑制組的 1.41 倍，而 80、60、40、20 μg·mL-14 個(gè)劑量組的LEGPS-Ⅱ可以較大地提高被ConA誘導(dǎo)的MΦ分泌IL-1β的水平，并在此藥物濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴性。

2.3 LEGPS-Ⅱ?qū)γ庖咭种菩∈蟾骨籑Ф體外分泌TNF-α的影響 如圖3所示，與免疫抑制組相比，40、80 μg·mL-1這 2 個(gè) LEGPS-Ⅱ單獨(dú)刺激組的抑制率超過(guò)了ConA單獨(dú)刺激組；而同劑量的LEGPS-Ⅱ聯(lián)合ConA刺激組與ConA單獨(dú)刺激組相比明顯提高。這說(shuō)明，LEGPS-Ⅱ可促使靜止的和被ConA活化的被免疫抑制的MФ分泌TNF-α的量增加，并具有一定的劑量依賴性。

圖2 LEGPS-Ⅱ?qū)γ庖咭种菩∈蟾骨籑Φ體外分泌IL-1β的影響(±s,n=6)Fig 2 Effects of LEGPS-Ⅱon the cytokine about IL-1β from phagocytosis of peritoneal macrophage in immunosuppressive mice(±s,n=6)

圖3 LEGPS-Ⅱ?qū)γ庖咭种菩∈蟾骨籑Ф體外分泌TNF-α的影響 (±s,n=6)Fig 3 Effects of LEGPS-Ⅱon the cytokine about TNF-α from phagocytosis of peritoneal macrophage in immunosuppressive mice(±s,n=6)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了LEGPS-Ⅱ?qū)π∈蟾骨籑Φ的體外吞噬能力及對(duì)IL-1β和TNF-α分泌的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LEGPS-Ⅱ在 0.03125～0.25 μg·mL-1范圍內(nèi)可使靜止的以及被ConA[6]誘導(dǎo)激活的免疫抑制小鼠的腹腔MΦ吞噬能力增加，并具有劑量依賴性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，ConA單獨(dú)刺激MΦ的吞噬能力高于LEGPS-Ⅱ各劑量組，兩者合用并沒有表現(xiàn)出聯(lián)合作用，反而使單用ConA時(shí)的作用減弱，小劑量LEGPS-Ⅱ即可表現(xiàn)出對(duì)ConA作用的拮抗，隨著濃度增加而逐漸增強(qiáng)，由此提示，LEGPS-Ⅱ有可能在MΦ表面有結(jié)合位點(diǎn)，而且部位與ConA在MΦ表面的絲裂原受體接近或重疊，因此表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制，但這點(diǎn)有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。被活化MΦ的吞噬能力呈現(xiàn)出對(duì)LEGPS-Ⅱ的劑量依賴性，當(dāng)LEGPS-Ⅱ的濃度不斷加大，其轉(zhuǎn)為向下調(diào)節(jié)被活化MΦ的吞噬能力，這有可能對(duì)發(fā)生過(guò)度非特異免疫應(yīng)答起到一定的保護(hù)作用。

LEGPS-Ⅱ并不能單獨(dú)刺激已被免疫抑制的MΦ分泌更多的IL-1β[7]，但此MΦ被ConA激活后，20~80 μg·mL-1LEGPS-Ⅱ則可促進(jìn)其分泌 IL-1β，并且均高于ConA單獨(dú)刺激的效果，表現(xiàn)出劑量依賴性。因此分析，LEGPS-Ⅱ?qū)罨木奘杉?xì)胞分泌IL-1β的促進(jìn)作用更明顯，而對(duì)免疫抑制的靜止巨噬細(xì)胞效果欠佳，增大LEGPS-Ⅱ的劑量亦不能使巨噬細(xì)胞IL-1β分泌增加。推測(cè)在病原體感染（此時(shí)巨噬細(xì)胞被病原體激活）或其他刺激原存在情況下，LEGPS-Ⅱ可能對(duì)于正常個(gè)體或免疫功能抑制個(gè)體具有較好的上調(diào)IL-1β水平的作用，進(jìn)而上調(diào)巨噬細(xì)胞非特異免疫功能，提高機(jī)體的防病、抗病能力。對(duì)于免疫抑制的靜止巨噬細(xì)胞，較大劑量的LEGPS-Ⅱ可以明顯地增加TNF-α的產(chǎn)生[8]，而對(duì)于免疫抑制的活化巨噬細(xì)胞，各個(gè)劑量的LEGPS-Ⅱ均可以促使其分泌TNF-α增多。由此可見，處于免疫抑制狀態(tài)下的靜止巨噬細(xì)胞對(duì)LEGPS-Ⅱ敏感度低，需要增大LEGPS-Ⅱ的濃度才能刺激巨噬細(xì)胞更多地分泌TNF-α，而當(dāng)免疫抑制狀態(tài)的巨噬細(xì)胞被激活，LEGPS-Ⅱ使TNF-α的分泌量增加，且與ConA有聯(lián)合作用。

從以上LEGPS-Ⅱ?qū)π∈蟾骨痪奘杉?xì)胞的免疫功能調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)中可以看到，LEGPS-Ⅱ可以增加免疫抑制條件下靜止的、活化的巨噬細(xì)胞的體外吞噬能力，以及TNF-α的生成能力；促進(jìn)免疫抑制條件下活化的巨噬細(xì)胞體外分泌IL-1β。

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