唐嘯威 ，謝文利 ，陳 虹 ，，田丹麗 ，左 松 ，白淑芳

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070；2.武警醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室，天津 300162）

鬼臼毒素類化合物具有很好的抗腫瘤活性，依托泊苷和替尼泊苷是臨床上長期使用的鬼臼類抗癌藥物[1]，據(jù)文獻(xiàn)報道，鬼臼毒素類化合物的細(xì)胞毒性作用機(jī)制主要有2種:（1）抑制微管組裝；（2）抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性[1-4]。然而，這類化合物還存在水溶性差、獲得性耐藥、骨髓抑制和嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)[5]。由 Knaack 等[6-8]報道的 indibulin（D-24851）是一類新型的小分子微管蛋白抑制劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為 N-(吡啶-4-基)-[1-(4-氯芐基)吲哚-3-基]草酰胺，該化合物在體內(nèi)和體外抗腫瘤實驗中均顯示出很強(qiáng)的抗腫瘤活性，現(xiàn)已作為抗腫瘤候選藥物進(jìn)入臨床研究階段。而根據(jù)前期的構(gòu)效關(guān)系研究[9]，鬼臼類抗腫瘤藥物的最佳修飾點在4位，且保持4位的β構(gòu)型很重要。本課題組以抗腫瘤獲選藥物indibulin和鬼臼毒素為先導(dǎo)化合物，根據(jù)藥物結(jié)構(gòu)拼合原理，在前期研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成了一系列的鬼臼毒素衍生物，以期得到對多藥耐藥有效、低毒高效的抗腫瘤化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 所用儀器為XT顯微熔點儀 (溫度未經(jīng)校正)；高分辨質(zhì)譜儀Agilent 6210 LC-TOF。4’-去甲表鬼臼毒素購自上海金和生物技術(shù)有限公司，純度均為98%；氫化鈉為市售分析純，含量為57%；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）使用前用 4魡 分子篩預(yù)干燥處理；無水乙醚和四氫呋喃（THF）均用硫酸鈉預(yù)干燥后加入鈉回流，二苯甲酮作為檢測，當(dāng)溶液變?yōu)樯钏{(lán)色后蒸出備用；無水二氯甲烷用五氧化二磷回流4 h后現(xiàn)蒸現(xiàn)用。其余試劑均為市售的分析純或化學(xué)純試劑。陽性對照藥依托泊苷（VP-16），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字號：H32025583，產(chǎn)品批號：09090731。

1.2 合成方法

1.2.1 合成路線 目標(biāo)化合物的合成路線如圖1。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線Fig 1 Synthetic route of title compounds

1.2.2 4β-疊氮-4’-去甲表鬼臼毒素的合成 將4’-去甲表鬼臼毒素 4.14 g（10 mmol）溶于 50 mL 干燥二氯甲烷中，加入疊氮鈉 2.60 g（40 mmol），攪拌使其溶解,緩慢滴加10 mL三氟乙酸至反應(yīng)液中,回流5 h。TLC檢測反應(yīng)完成后，滴入碳酸氫鈉飽和溶液除去過量的酸，至無氣泡為止，萃取分出有機(jī)層，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干，粗品用二氯甲烷:乙酸乙酯（v/v=1∶1）重結(jié)晶，得白色晶體 3.99 g，收率 91%。

1.2.3 4β-氨基-4’-去甲表鬼臼毒素的合成 將4β-疊氮-4’-去甲表鬼臼毒素 4.39 g（10 mmol）溶于50 mL乙酸乙酯中，加入體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%鈀碳1.00 g，甲酸銨2.52 g(40 mmol)，加熱回流攪拌5 h，TLC檢測反應(yīng)完全，濾液用飽和食鹽水洗3遍，減壓蒸干得白色泡沫狀固體粗產(chǎn)物3.63 g，收率83%，粗品可直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.4 化合物5a-5h的合成通法 將質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%氫化鈉 0.51 g（20 mmol）溶于 5 mL 干燥 N，N-二甲基甲酰胺中，冰浴下，將5-甲氧基吲哚1.19 g（10 mmol）的N，N-二甲基甲酰胺溶液滴入氫化鈉溶液中，加入完畢后，移去冰浴，室溫攪拌反應(yīng)5 h。冰浴下加入鹵代物（12 mmol），移去冰浴，室溫攪拌，TLC檢測反應(yīng)完畢。將反應(yīng)液倒入冰水混合物，不斷攪拌，直至析出固體不再增加，抽濾得固體，40℃減壓干燥24 h，得到粗品，粗品直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.5 化合物6a-6h的合成通法 將上述制備的1-取代5-甲氧基吲哚（5.0 mmol）溶于20 mL無水乙醚，冰浴冷卻反應(yīng)液至0℃，在此溫度下，將草酰氯0.58 mL（6.5 mmol）緩慢滴加至反應(yīng)瓶中，滴加完畢后，室溫攪拌反應(yīng)3～6 h，抽濾，用預(yù)干燥的石油醚洗滌，粗品不經(jīng)分離純化可直接用于下一步反應(yīng)。

1.2.6 化合物7a-7h的合成通法 將4β-氨基-4’-去甲表鬼臼毒素0.42 g（1.0 mmol）與制備的化合物6a-6h（2.0 mmol）溶于15 mL干燥二氯甲烷中，攪拌使其溶解，滴加兩滴三乙胺，室溫反應(yīng)4～12 h。反應(yīng)完畢，飽和食鹽水洗3遍，分出有機(jī)層，減壓蒸干得粗品，粗品經(jīng)硅膠柱層析（石油醚－乙酸乙酯=1:1）純化得產(chǎn)品。

1.3 MTT法檢測體外抗腫瘤活性 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔約含4000個細(xì)胞，置37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后給藥組加入測試物，至少設(shè)3個平行孔，陰性對照組加入與給藥組等體積的溶劑，并設(shè)只加培養(yǎng)基的空白對照組，置37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，每孔加50 μL 1 mg/mL MTT溶液（PBS配制），37℃孵育 4 h，棄上清，每孔加入 DMSO 150 μL溶解甲臜顆粒，輕度振蕩溶解。在酶標(biāo)儀波長490 nm條件下測定光密度值（OD），用下面公式計算化合物對細(xì)胞的抑制率，根據(jù)計算出的抑制率和相應(yīng)的濃度用Excel工作表擬合出相關(guān)聯(lián)的曲線，推測出IC50值，實驗平行3次。

抑制率=(陰性對照組OD值-加藥組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%[10]

2 結(jié)果

2.1 對合成的8個目標(biāo)化合物進(jìn)行了高分辨質(zhì)譜的確定以及熔點的確定，具體理化常數(shù)及波普數(shù)據(jù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物的理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)Tab 1 The experimental and spectral data of target compounds

2.2 藥理活性測定結(jié)果表明，所測試的8個化合物對人宮頸癌細(xì)胞Hela顯示出不同程度的抑制活性，其中7a、7b的抗腫瘤活性優(yōu)于對照藥物依托泊苷，化合物7g、7h的體外抗腫瘤活性相當(dāng)于對照藥物依托泊苷。見表2。

表2 目標(biāo)化合物對Hela細(xì)胞增殖的抑制活性（±s,n=3）Tab 2 Inhibitory activity of target compounds against Hela cell proliferation（±s,n=3）

表2 目標(biāo)化合物對Hela細(xì)胞增殖的抑制活性（±s,n=3）Tab 2 Inhibitory activity of target compounds against Hela cell proliferation（±s,n=3）

IC50(μmol·L-1)1.12±0.130.58±0.2016.01±3.0710.01±1.42>10079.96±2.118.19±0.783.56±1.342.11±1.17化合物7a 7b 7c 7d 7e 7f 7g 7h依托泊苷

3 討論

構(gòu)-效關(guān)系表明，N位芐基的對位有給電子基團(tuán)效果不好，如7e、7f基本沒有抗腫瘤活性；N位芐基的鄰位的鹵素有弱的吸電子作用，因此7c、7d的IC50濃度雖然比VP-16的濃度大，但表現(xiàn)出較弱的抗腫瘤活性；7h芐基上間位氯原子強(qiáng)的吸電子效應(yīng)，活性與VP16相當(dāng)。因此，吲哚N位上的取代基對吲哚草酰類鬼臼毒素衍生物的抗腫瘤活性影響很大，其中吲哚N位芐基上的吸電子基的衍生物值得進(jìn)一步研究。

在合成路線的選擇上，先選擇修飾吲哚的N位?？紤]到吲哚3位引入去甲表鬼臼毒素，而吲哚N位引進(jìn)R基時需要用到強(qiáng)堿，會破壞去甲表鬼臼毒素的內(nèi)酯環(huán)。關(guān)于溶劑的選擇：（1）在吲哚N位烴化的過程中，筆者采用NaH活化N-H，以干燥DMF為溶劑。選此溶劑的優(yōu)點是：當(dāng)反應(yīng)完成后，由于生成物結(jié)構(gòu)中沒有對堿敏感的基團(tuán)，DMF能與水互溶而生成物不溶于水，所以采用打漿法將DMF傾入冰水中，可以簡便地得到產(chǎn)物而不需經(jīng)過色譜分離；但是在該過程中，DMF的用量不能過大，否則會導(dǎo)致產(chǎn)物不能完全析出且產(chǎn)物粘稠不易干燥。（2）在3位引入草?；倪^程中，筆者使用干燥乙醚作為溶劑，該選擇具有顯著優(yōu)勢：當(dāng)3位生成酰氯后，得到的產(chǎn)物極性大大增加，將迅速從乙醚中析出。此外，待反應(yīng)完畢后可以加入適量的干燥石油醚，從而使溶劑的極性進(jìn)一步減小，有利于產(chǎn)物的充分析出。

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