林玉紅 楊娟英 謝 偉 王月茹 陜西步長制藥有限公司(西安 710075)

益心解毒顆粒由黃芪、麥冬、地黃、金銀花、黃連、五味子、防風(fēng)、酸棗仁和丹參等中藥材組成,具有益氣養(yǎng)陰,清熱解毒之功效。用于病毒性心肌炎氣陰兩虛、熱侵心包證型。證見心悸,氣短,胸悶不適,乏力,低熱,咽干咽痛,五心煩熱,心煩,多汗,失眠,舌淡紅或舌紅,苔薄黃或薄白,脈沉細(xì)或結(jié)代者。為能有效控制益心解毒顆粒的質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法及高效液相色譜法對其進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。

1 儀器與試藥 1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀,Alltech500型 ELSD檢測器,M illennium 32色譜工作站。

1.2 試藥 黃芪甲苷對照品、鹽酸小檗堿對照品、金銀花對照藥材、綠原酸對照品、麥冬對照藥材、原兒茶醛對照品、五味子乙素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供),甲醇、乙腈均為色譜純,其他試劑均為分析純。益心解毒顆粒由山東步長制藥有限公司生產(chǎn)提供。

2 方法與結(jié)果 2.1 薄層層析定性鑒別 2.1.1 麥冬的薄層鑒別:取本品 6g,加水 30m L,加熱使溶解,加入 1.5m L鹽酸,加熱煮沸 10min,放冷,加水補(bǔ)足至 30m L,加氯仿提取 3次,每次 30m L,合并提取液,濃縮至約 2m L,作為供試品溶液;另取麥冬對照藥材 2g,加水30m L,煎煮 20min,濾過,濾液加鹽酸0.5m L,同法制成對照藥材溶液;照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn),吸取供試品溶液 4μL,對照藥材溶液8μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以氯仿-丙酮 (7:1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以 10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn),而陰性無干擾。

2.1.2 金銀花的薄層鑒別:取本品 4g,加水30m L,加熱使溶解,放冷 ,加鹽酸調(diào) p H值=1～ 2,用醋酸乙酯提取 3次,每次 15m L,合并醋酸乙酯提取液,蒸干,殘?jiān)蛹状?5m L使溶解,作為供試品溶液;另取金銀花對照藥材 0.5g,加甲醇 15m L,超聲處理 20min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?m L使溶解,作為對照藥材溶液;再取綠原酸對照品,加甲醇制成每 1m L含 1mg的溶液,作為對照品溶液;照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn),吸取供試品溶液5μL,對照藥材溶液 3μL,對照品溶液 2μL,分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上,以 25%冰醋酸溶液為展開劑 (展距 6cm),展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視,供試品色譜中,分別在與對照品色譜及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),而陰性無干擾。

2.1.3 黃連的薄層鑒別:取本品 1g,加乙醇20m L,超聲處理 20min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?m l使溶解,作為供試品溶液;另取黃連對照藥材 0.5g,同法制成對照藥材溶液;再取鹽酸小檗堿對照品,加甲醇制成每 1m L含 0.5mg的溶液,作為對照品溶液;照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn),吸取上述三種溶液各 5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上,以正丁醇-冰醋酸-水(7∶ 1∶2)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視,供試品色譜中,在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),而陰性無干擾。

2.1.4 五味子的薄層鑒別:取本品 10g,加水40m L,加熱使溶解,放冷,用水飽和的乙醚提取 2次,每次 20m L,合并提取液,揮去乙醚,殘?jiān)哟姿嵋阴?m L使溶解,作為供試品溶液;另取五味子乙素對照品,加醋酸乙酯制成每 1m L含 1m g的溶液,作為對照品溶液;照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn),吸取供試品溶液 10μL,對照品溶液 4μL,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以甲苯-醋酸乙酯(9∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性無干擾。

2.1.5 丹參的薄層鑒別:取本品8g,加鹽酸溶液(5→100)40m L,水浴加熱 1h,用水飽和的乙醚提取 2次,每次 40m L,合并乙醚液,回收乙醚至約 15m L,用2%碳酸鈉水溶液洗滌 2次,每次 10m L,合并堿液,加鹽酸調(diào) PH值至 2,用水飽和的乙醚提取 3次,每次15m L,合并提取液,揮干,殘?jiān)蛹状?2m L使溶解,作為供試品溶液;另取原兒茶醛對照品,加甲醇制成每1m L含 0.5mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn),吸取供試品溶液 10μL,對照品溶液 2μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上,以甲苯-醋酸乙酯-甲酸 (15∶ 10∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以新鮮配制的 1%間苯三酚乙醇-濃硫酸 (1∶ 1)的混合溶液,供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性無干擾。

2.2 黃芪甲苷含量測定 2.2.1 色譜條件:色譜柱:Kromosil ODSC18(5μm,4.6mm×250mm);流動相:乙腈 -水 (32∶ 68);柱溫:40℃;流速 ,1.2m L/min;漂移管溫度:105℃;載氣流量:2.5L? min-1;放大系數(shù):1[1]。

2.2.2 對照品溶液的制備:取黃芪甲苷對照品適量,加甲醇制成每 1m L含 0.5mg的溶液,作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備:精確稱取益心解毒顆粒約 10g,置于錐形瓶中,加入甲醇 50m L,超聲處理30min,濾過,棄去初濾液,精密移取續(xù)濾液 25m L,水浴蒸干,殘?jiān)铀?0m L溶解,并用石油醚萃取 4次,每次10m L,棄去石油醚層,水層揮發(fā)至無醚味;繼續(xù)用飽和正丁醇萃取 3次,每次 10m L,合并正丁醇提取液,用1%的氫氧化鈉溶液洗滌3次,每次15m L,棄去氫氧化鈉溶液,將正丁醇溶液蒸干,殘?jiān)尤?4m L甲醇溶解,并用 0.45μm微孔濾膜濾過,即得。

2.2.4 空白試驗(yàn):陰性對照的制備:以處方中藥味比例和制備工藝制成不含白芍的空白樣品,再按供試品制備方法處理,制成陰性對照溶液。吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液 10μL注入液相色譜儀,依法測定。結(jié)果對照品溶液與供試品溶液在相同的保留時(shí)間有相應(yīng)的峰,而陰性對照沒有。說明測定的專屬性好、無干擾。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液 (濃度 0.48mg/m l)2、 4、6、8、10μL,按上述色譜條件注入色譜儀,以峰面積為縱坐標(biāo),黃芪甲苷進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為 Y=1215244X+25631.3,相關(guān)系數(shù) r=0.9998,黃芪甲苷在 0.96μg～ 4.8μg之間有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn):取黃芪甲苷對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,結(jié)果 RSD為0.3%,表明本方法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn):取本品適量,共 6份,照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,分別精密取 10μL進(jìn)樣,在上述色譜條件下測得樣品,RSD為 1.36%,結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn):采取加樣回收法,取一定量已知含量的樣品 6份,分別加入黃芪甲苷對照品適量,照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下測定含量,計(jì)算回收率(見表1)。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn):精密取本品適量,照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液 ,分別于 0、 2、 4、 8、 12、24h進(jìn)樣,記錄峰面積,結(jié)果 RSD為 1.38%,表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 樣品的含量測定:取本品 3批樣(10g/袋),照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,依上述色譜條件測定,其中含黃芪甲苷的最高為 1.38mg/袋,最低為 1.21 mg/袋,考慮到藥材的來源,參考其他黃芪制劑含量限量,暫定本品每袋含黃芪以黃芪甲苷計(jì),不得少于1.20mg,并規(guī)定本品所用黃芪藥材含黃芪甲苷按《中國藥典》2010年版一部黃芪項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

3 小結(jié)與討論 在薄層鑒別研究中[1],我們曾對處方中地黃、防風(fēng)和酸棗仁進(jìn)行鑒別,根據(jù)藥典和文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行了供試品溶液的制備,由于處方中所含化學(xué)成分種類多,性質(zhì)相似,通過采用多種方法進(jìn)行了探討,但均未獲得滿意的結(jié)果,無法得到穩(wěn)定的薄層鑒別方法,故均未收入標(biāo)準(zhǔn)正文。

目前,有關(guān)黃芪甲苷含量測定的方法已有不少報(bào)道[2,3,4],多采用薄層掃描法、比色法等。益心解毒顆粒中除君藥黃芪外,還有炙甘草等藥材均含有較多皂苷類成分,會嚴(yán)重干擾黃芪甲苷的測定。為此,我們在實(shí)驗(yàn)中采用多種供試品制備方法以及多種色譜條件的嘗試,最終確定了本實(shí)驗(yàn)中所述的最佳條件。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 [M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[2] 王 寶 ,蘇 健,魯 靜.黃芪甲大甙的檢測在中藥質(zhì)控中的應(yīng)用[J].中國中藥雜志,1996,21(3):161-164.

[3] 龍恩武,張一萍.黃芪及其制劑中黃芪甲苷測定方法研究進(jìn)展 [J].時(shí)珍國醫(yī)國藥 ,2000,11(9):854-855.

[4] 李 江 ,李穎倩.黃芪甲甙分析方法研究概況 [J].北京中醫(yī),2000,19(4):50-51.