馮 俊，李 麗，劉 海，劉世喜

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，四川 成都 610041;2.川北醫(yī)學(xué)院病理教研室;3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，四川 南充 637000)

1 噬菌體展示技術(shù)的研究歷史

噬菌體展示技術(shù)是近年才發(fā)展起來(lái)并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù)，Smith［1］于1985年首次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，使編碼的目的基因的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)，將絲狀噬菌體fd基因組通過(guò)基因工程的手段進(jìn)行改造，將EcoRⅠ內(nèi)切酶的部分基因片段與PⅢ基因融合，獲得的重組噬菌體可在體外穩(wěn)定增生。1988年P(guān)annley et等［2］，將已知抗原決定族與PⅢ的N端融合呈現(xiàn)在表面，可特異性地被抗體選擇出來(lái)，并提出通過(guò)構(gòu)建隨機(jī)肽庫(kù)可以了解抗體識(shí)別的抗原決定簇表位的設(shè)想。

2 噬菌體展示技術(shù)的基本原理

噬菌體展示技術(shù)是一種親和選擇和基因表達(dá)產(chǎn)物相結(jié)合的技術(shù)，以改造的噬菌體為載體，將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白將展示在病毒顆粒的表面，而編碼這個(gè)融合子的DNA則位于該病毒粒子內(nèi)，通過(guò)檢測(cè)病毒內(nèi)部的DNA來(lái)測(cè)定融合蛋白序列。噬菌體展示技術(shù)使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使得各種靶分子的多肽配體通過(guò)一種被稱為淘選的體外選擇程序得以快速鑒定(如圖1)。噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白PIlI和PⅧ均可作為載體來(lái)展示外源多肽或蛋白質(zhì)。在成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)與信號(hào)肽之間有單一的克隆位點(diǎn)用于插入，插入的外源多肽或蛋白質(zhì)以融合的形式表達(dá)在病毒粒子的表面，外源多肽或蛋白的插入結(jié)合點(diǎn)在N端，與PⅧ基因融合時(shí)，拷貝數(shù)高，可達(dá)2700個(gè);與PllI基因融合時(shí)拷貝數(shù)低(約5個(gè)拷貝數(shù))，利于選擇高親和力的配體分子，因而可對(duì)插入較大的片段進(jìn)行篩選。

3 噬菌體展示系統(tǒng)

3.1 單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)

絲狀噬菌體常見(jiàn)的如M13、f1、fd等是單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白;PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白;PⅢ位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染所必須的［3］。PⅧ位于噬菌體外側(cè)，N端伸出噬菌體外，C端與DNA結(jié)合，每個(gè)病毒顆粒大約有2700個(gè)拷貝。此外，尚有絲狀噬菌體PVI展示系統(tǒng)的研究報(bào)道［4］PVI蛋白可以作為外源蛋白的融合位點(diǎn)，可以用于研究外源蛋白C端結(jié)構(gòu)區(qū)域功能，從而用于cDNA展示文庫(kù)的構(gòu)建。

3.2 λ噬菌體展示系統(tǒng)

λ噬菌體的尾部管狀部分由PV蛋白構(gòu)成，由32個(gè)盤(pán)狀結(jié)構(gòu)組成尾部管狀結(jié)構(gòu)，由6個(gè)PV亞基組成一個(gè)盤(pán)狀結(jié)構(gòu)。PV有兩個(gè)折疊區(qū)域，外源序列替換或插入在c端的折疊結(jié)構(gòu)域。λ噬菌體的D蛋白參與野生型噬菌體頭部的裝配。

3.3 T4噬菌體展示系統(tǒng)

T4噬菌體展示系統(tǒng)是將噬菌體衣殼表面上的SOC外殼蛋白和HOC融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失，故而T4可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)。

4 噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用

4.1 噬菌體隨機(jī)多肽文庫(kù)

肽庫(kù)由感染性噬菌體構(gòu)成，通過(guò)淘選可以富集與靶分子結(jié)合的噬菌體。隨機(jī)肽庫(kù)的篩選分子包括抗體、細(xì)胞表面受體類、小分子、完整細(xì)胞、細(xì)胞分子類［5，6］等，這些分子謂之受體，篩選出的結(jié)合該類受體的目的分子稱為配體。目前應(yīng)用較多的是進(jìn)行抗體的表位分析，而篩選出的配體常常展示了抗原抗體的結(jié)合部位。噬菌體展示肽庫(kù)發(fā)展較快，已由最初的6肽、7肽、發(fā)展到9肽、15肽，直到38肽、40肽［7，8］。Blond-Elguindi［9］等采用甲胎蛋白(AFP)洗脫的策略篩選出Bip結(jié)合短肽的共有序列，闡明Bip識(shí)別和蛋白質(zhì)折疊的機(jī)制。Doorbar［10］等采用競(jìng)爭(zhēng)洗脫的方法篩選出細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合的短肽;張旭［11］等成功地篩選出肝癌特異性的短肽FQPLPAT;Pasqualini［12］等成功地篩選出腸和胃組織特異性的短肽，以及我們最近利用噬菌體隨機(jī)展示技術(shù)篩選出喉癌特異性結(jié)合的短肽-WPSTYMNPFNRS(未發(fā)表)等。

4.2 抗體工程與噬菌體展示技術(shù)

利用噬菌體展示技術(shù)可篩選到親和力和特異性都較高的抗體，噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展使抗體工程進(jìn)入又一次革命。McCaffery［13］等證實(shí)，完整的抗體可變區(qū)可展示于噬菌體的表面，通過(guò)篩選獲得了與已知抗原特異性結(jié)合的抗體片段。Hogrefe［14］等篩選到特異的Fab片段。噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建和單克隆抗體的篩選是噬菌體展示技術(shù)的成功應(yīng)用。

4.3 蛋白質(zhì)工程與噬菌體展示技術(shù)

4.3.1 新受體和配體的發(fā)現(xiàn):利用噬菌體展示技術(shù)，最近發(fā)現(xiàn)了一些新的受體及其配體［15－17］。Heiskanen等用完整的Puumala漢坦病毒進(jìn)行淘選，其分離的多肽能與漢坦病毒結(jié)合，并使該病毒不能感染或結(jié)合細(xì)胞。

4.3.2 蛋白與蛋白間相互作用的研究:噬菌體展示技術(shù)和蛋白水解作用相結(jié)合可篩選穩(wěn)定折疊的蛋白，從而能更好的研究蛋白與蛋白間相互作用［18－21］。由于這種方法不依賴蛋白的特異性，理論上講它適用于任何蛋白，故用此種方法可生產(chǎn)新的高適溫性蛋白，可使多肽片段形成新的折疊結(jié)構(gòu)域，部分折疊區(qū)形成完全折疊。

4.3.3 蛋白質(zhì)的定向設(shè)計(jì)和空間結(jié)構(gòu):可用來(lái)篩選細(xì)胞因子、酶抑制劑、細(xì)胞因子拮抗劑、轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合位點(diǎn)、新型酶和生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)等領(lǐng)域。

4.3.4 抗原表位分析:抗原表位分析在研究抗原一抗體反應(yīng)機(jī)制方面具有重要意義，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出任何抗原的特定抗體［22，23］。此技術(shù)還可用于設(shè)計(jì)多肽疫苗、研制診斷試劑和篩選藥物等領(lǐng)域。Motti［24］用15肽庫(kù)篩選2株抗人乙肝表面抗原，而獲得的多肽不僅可以與抗人乙肝表面抗原單抗結(jié)合，而且可被乙肝患者的血清抗體識(shí)別。

4.3.5 噬菌體展示技術(shù)與藥物工程:由于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系不夠了解，以往只能通過(guò)大規(guī)模的定點(diǎn)突變和單個(gè)目的蛋白的克隆表達(dá)純化與篩選來(lái)修飾現(xiàn)有蛋白，此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而使用噬菌體展示技術(shù)就可以簡(jiǎn)便快速地獲得與靶分子具有強(qiáng)親和力和特異性的小肽或新型蛋白作為候選藥物開(kāi)發(fā)。目前該技術(shù)已廣泛用于癌癥的靶向治療，組織器官移植、艾滋病、心血管病、神經(jīng)性疾病等領(lǐng)域藥物的研究和開(kāi)發(fā)，并已篩選出大量的受體拮抗物、酶抑制劑等［25］。

5 問(wèn)題與展望

綜上所述，噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛［26－32］，為后來(lái)的研究者提供了嶄新的研究方向。其中，定位抗原表位是最具應(yīng)用前景的;運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)可篩選出與腫瘤細(xì)胞特異結(jié)合的多肽，從而為腫瘤的靶向治療提供了可能。另外，噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)亦還有很多不足需要改進(jìn)方面:如篩選的特異性不高、如何更有效的避免篩選背景的影響、提高庫(kù)容量;改善密碼子的表達(dá)偏性等。但相信不久的將來(lái)，隨著該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和完善，人們完全可以篩選和鑒別出更多、更廣的靶分子，并創(chuàng)造出具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的模擬肽;使噬菌體展示技術(shù)在更多領(lǐng)域中應(yīng)用，產(chǎn)生更深遠(yuǎn)的影響。

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