文 / 王 琴 楊 靜 任遠(yuǎn)慶 新疆克拉瑪依綠成公司

三聚氰胺俗稱密胺、蛋白精，為白色單斜晶體，幾乎無(wú)味，微溶于水（常溫下溶解度為3.1 g/L），是制造三聚氰胺甲醛樹(shù)脂的原料。該樹(shù)脂常用于制造日用器具、裝飾貼面板、織物整理劑等。食品工業(yè)中經(jīng)常需要測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，由于直接檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)比較復(fù)雜，所以常用凱氏定氮法，通過(guò)測(cè)定氮原子的含量來(lái)間接推算食品中蛋白質(zhì)的含量。由于三聚氰胺（含氮量66%）與蛋白質(zhì)（平均含氮量16%）相比含更高比例的氮原子，所以被一些商家利用，添加在食品、飼料中，造成蛋白質(zhì)含量比較高的假相。2007年，國(guó)內(nèi)外發(fā)生多起寵物因食用添加了三聚氰胺的寵物食品而致死的例子，大量相關(guān)產(chǎn)品被召回。2008年9月，國(guó)內(nèi)又發(fā)生了在奶粉中添加三聚氰胺導(dǎo)致嬰幼兒腎結(jié)石和腎功能衰竭甚至死亡的惡性事件。

本文參考《GB/T 22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》、《GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè)—液相色譜法》中的樣品處理方法，采用C8柱檢測(cè)了原料奶、巴氏奶、酸牛奶和乳飲料中的三聚氰胺含量，并對(duì)檢測(cè)中常見(jiàn)的問(wèn)題進(jìn)行了分析。

1 高效液相色譜法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

試樣用三氯乙酸-乙腈溶液進(jìn)行提取，經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。

1.2 試劑與材料

實(shí)驗(yàn)中所采用的試劑，除非另有說(shuō)明，均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.2.1 試劑

甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；氨水（含量為25%～28%）；三氯乙酸；檸檬酸；辛烷磺酸鈉（色譜純）；甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50 mL甲醇和50 mL 水，混勻后備用；三氯乙酸溶液（1%）：準(zhǔn)確稱取10 g 三氯乙酸于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用；氨化甲醇溶液（5%）：準(zhǔn)確量取5 mL 氨水和95 mL甲醇，混勻后備用。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 空白實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)圖譜

表1 保留時(shí)間與峰面積的重現(xiàn)性

離子對(duì)試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10 g 檸檬酸和2.16 g 辛烷磺酸鈉，加入約980 mL 水溶解，調(diào)節(jié)pH值至3.0 后，定容至1 L 備用；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 108-78-01，純度大于99.0%；

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃避光保存。

1.2.2 材料

陽(yáng)離子交換固相萃取柱：混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，柱管體積3 mL，或相當(dāng)者。使用前依次用3 mL甲醇、5 mL 水活化；定性濾紙；微孔濾膜：0.2 μm，有機(jī)相；氮?dú)猓杭兌取?9.999%。

1.3 儀器和設(shè)備

高效液相色譜（HPLC）儀：島津Prominence LC-20A 高效液相色譜儀系統(tǒng)，具體配置為L(zhǎng)C-20AD輸液泵，DGC-20A3在線脫氣，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10AC柱溫箱，SPD-20A紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，CBM-20A控制器和LCscolution 色譜工作站；分析天平（感量為0.0001 g和0.01 g）；離心機(jī)（轉(zhuǎn)速不低于4 000 rpm）；超聲波水浴；固相萃取裝置；氮?dú)獯蹈蓛x；渦旋混合器；具塞塑料離心管（10 mL）。

1.4 方法

1.4.1 液態(tài)乳制品的提取方法

量取0.4 g（精確至0.001 mL）試樣于10 mL具塞塑料離心管中，加入3 mL三氯乙酸溶液和1.25 mL乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于4 000 rpm離心10 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過(guò)濾后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。

1.4.2 凈化

將1.4.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脫。整個(gè)固相萃取過(guò)程流速不超過(guò)1 mL/min。洗脫液于50 ℃下用氮?dú)獯蹈?，殘留物（相?dāng)于0.08 g樣品）用1 mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1 min，過(guò)微孔濾膜后，供HPLC測(cè)定。

1.4.3 高效液相色譜條件

色譜柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者；流動(dòng)相：C8柱，離子對(duì)試劑緩沖液：乙腈（85∶15，體積比），混勻；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃； 波長(zhǎng)：240 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

用流動(dòng)相〔甲醇（20 mL）+水（80 mL）混合液〕將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為0.8、2.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，并用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾后注入樣品瓶中用于色譜測(cè)定。

1.5 結(jié)果計(jì)算

試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計(jì)算獲得：

式中：

X —— 試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

A ——樣液中三聚氰胺的峰面積；

c —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V —— 樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；

As —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積；

m —— 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

f —— 稀釋倍數(shù)。

結(jié)合樣品處理得，f=5，m=0.4，V=1，即X= 12.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）及回歸方程，相關(guān)系數(shù)為0.9999，因此三聚氰胺溶液在質(zhì)量濃度為0.8～80.0 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其中20 μg/mL的檢測(cè)點(diǎn)偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線較大，影響R值，因此數(shù)據(jù)處理時(shí)被去掉。

2.2 空白樣品測(cè)定的色譜圖

除不稱取樣品外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行，空白實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)圖譜如圖2所示。

2.3 方法精密度分析

圖3 空白巴氏奶色譜圖

圖4 添加5 mg/kg三聚氰胺的巴氏奶色譜圖

圖5 添加80 mg/kg三聚氰胺巴氏奶的色譜圖

圖6 原料奶三聚氰胺檢測(cè)色譜圖

圖7 乳飲料的三聚氰胺檢測(cè)色譜圖

圖8 常溫放置30 天的20 mg/kg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

圖9 0.8、2、20、40、80 mg/kg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)色譜圖對(duì)比

取濃度為2 mg/kg的三聚氰胺標(biāo)樣，相同運(yùn)行條件下，連續(xù)進(jìn)樣5 次，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在現(xiàn)有設(shè)備和人員操作下，用國(guó)標(biāo)方法測(cè)定三聚氰胺具有很好的精密度和重現(xiàn)性，滿足RSD小于1%的要求，遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)小于10%的要求。

2.4 加標(biāo)回收率

取市售巴氏奶作為空白樣品，分別加入不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液，使三聚氰胺最終含量分別為5和80 mg/kg?？瞻装褪夏痰纳V圖如圖3所示。三聚氰胺出峰保留時(shí)間是10.402×5，三聚氰胺的實(shí)際檢測(cè)值為0.543 mg/kg。

圖4中三聚氰胺的出峰保留時(shí)間是10.331，三聚氰胺的實(shí)際檢測(cè)值為4.692 mg/kg。

圖5中三聚氰胺的出峰保留時(shí)間是10.297，三聚氰胺的實(shí)際檢測(cè)值為68.7 mg/kg。

由表2可知，當(dāng)牛奶的處理加樣量為0.4 g時(shí)， 5 mg/kg和80 mg/kg三聚氰胺的檢測(cè)回收率分別為87.51%和88.10%，回收率符合《GB/T22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》中所要求的在80%～110%之間。由于本方法的定量限為2 mg/kg，而市售巴氏奶檢測(cè)值小于2 mg/kg，可以標(biāo)明未檢出。

2.5 實(shí)際樣品分析結(jié)果

按本方法檢測(cè)原料奶、市售的巴氏奶和乳飲料，測(cè)得的三聚氰胺的濃度分別為0（未檢測(cè)出峰）（圖6）、0.543 mg/kg和0（未檢測(cè)出峰）（圖7），重現(xiàn)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確，適合對(duì)牛奶中三聚氰胺含量進(jìn)行批量檢測(cè)。

2 討論

采用高效液相色譜法檢測(cè)液態(tài)乳中三聚氰胺時(shí)遇到了以下一些問(wèn)題，需要引起注意：

2.1 所有實(shí)驗(yàn)用水均應(yīng)為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水，使用前應(yīng)經(jīng)過(guò)濾膜0.45 μm微孔進(jìn)行抽濾。所有試劑應(yīng)為分析純，流動(dòng)相B應(yīng)每次現(xiàn)配先用。

2.2 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配好后可以在4～6 ℃冷藏30 天。其它濃度標(biāo)準(zhǔn)品每次需現(xiàn)配現(xiàn)測(cè)，每次進(jìn)樣時(shí)都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品處理好后盡快檢測(cè)。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)有現(xiàn)配，也未冷藏存放時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線易出現(xiàn)基線不穩(wěn)和出峰不正常的情況（圖8）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液用水∶甲醇=80∶20配置。在實(shí)驗(yàn)中，若將標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液配置呈水∶甲醇=50∶50或20∶80，易出現(xiàn)雙峰或曲線不穩(wěn)的情況（圖9）。

2.4 防止交叉污染。陽(yáng)離子交換固相萃取柱、濾膜為一次性使用，實(shí)驗(yàn)用的容量瓶、注射器、試管、玻璃棒等重復(fù)使用的用具，在實(shí)驗(yàn)完畢后需用洗潔精清洗干凈，次氯酸鈉浸泡大于12 h，超聲波清洗，干燥后投入下次使用。

［1］中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn). GB/T 22388-2008.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［2］中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn). GB/T22400-2008. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.