張鎵小 張 慧 倪 沖 李春雪 康廷國(guó)

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

中藥通關(guān)藤為蘿藦科牛奶菜屬植物通關(guān)藤M(fèi)arsdenia tenacissima(Roxb．)Wight et Arn的干燥藤莖，又名通光散、烏骨藤等，主產(chǎn)于云南。始載于《滇南本草》［1］，具現(xiàn)代藥理證實(shí)具有平喘、降壓、抗菌、調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤等作用。目前臨床上作為治療腫瘤藥物用于胃癌、肝癌、宮頸癌等治療。通關(guān)藤主含C21甾體皂苷類 (主要是C21甾體的糖苷)和多糖，還含有少量生物堿及樹脂等 ，其中C21甾體皂苷類成分是通光藤抗炎、抗腫瘤及抗生育活性的物質(zhì)基礎(chǔ)［2，3］。

本課題組前期經(jīng)分離得到通關(guān)藤苷D等C21甾體皂苷類成分［4］，并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)通關(guān)藤苷D具有抗腫瘤活性?，F(xiàn)采用通關(guān)藤苷D為對(duì)照品，采用比色法測(cè)定通關(guān)藤中總皂苷的含量，同時(shí)比較了不同產(chǎn)地通關(guān)藤中總皂苷的含量，為通關(guān)藤藥材的質(zhì)量控制提供了可靠的分析方法和依據(jù)。以通關(guān)藤苷D為對(duì)照測(cè)定總皂苷含量，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV－3010紫外可見分光光度計(jì) (日本日立司);YB－IA真空干燥箱 (天津市鑫洲科技有限公司);HH－S型恒溫水浴鍋 (鞏義市予華儀器有限公司);RE－52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 通關(guān)藤苷D(105℃干燥至恒重)，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)新藥研發(fā)基地提供，純度98.2%;通關(guān)藤購(gòu)于安國(guó)市杏林藥材有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為蘿藦科牛奶菜屬植物通關(guān)藤M(fèi)arsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn的干燥藤莖。石油醚、氯仿、甲醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸、乙醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取藥材粉末120mg，置50mL錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲30min，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，濾過，即得。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取通關(guān)藤苷D 8mg，置50mL錐形瓶中，精密加入加甲醇50mL使溶解，制成濃度為0.16mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 陰性空白對(duì)照溶液的制備 不加藥材，照“2.1”項(xiàng)下方法制備陰性溶液。

2.4 樣品的測(cè)定 精密量取供試品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.5mL，分別置于10mL具塞試管中，于60℃水浴上揮干甲醇，加入香草醛－冰醋酸溶液0.4mL和高氯酸0.6mL，搖勻，70℃水浴加熱15min，取出后立即用流水冷卻，加入10mL冰醋酸稀釋，以不加樣品溶液的平行樣為空白。照紫外－可見分光光度法(《中國(guó)藥典》2010版一部附錄V A)在462nm處測(cè)定吸收度，同法測(cè)定對(duì)照品的吸收度，計(jì)算含量即得。

2.5 最佳測(cè)定條件的確定

2.5.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 照“2.4”項(xiàng)下方法操作，以不加樣品溶液的平行樣為空白。在紫外－可見分光光度計(jì)上以400～700nm范圍進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)均為462nm，為此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為462nm，見圖1～2。

2.5.2 陰性干擾試驗(yàn) 按“2.5.1”項(xiàng)下方法測(cè)定陰性液，結(jié)果顯示，陰性液不顯色，在462nm處無吸收，證明陰性液無干擾。

2.5.3 香草醛溶液濃度的確定 分別配制1%、3%、5%、7%、9%的香草醛－冰醋酸溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法為以香草醛－高氯酸法顯色后，在462nm處測(cè)定。各濃度條件下供試品顯色后吸收度分別為 0.334、0.418、0.524、0.531、0.519。結(jié)果顯示，當(dāng)香草醛－冰醋酸溶液的濃度低于5%時(shí)，樣品吸收度隨香草醛－冰醋酸溶液濃度的增大而增大;當(dāng)濃度增加至5%時(shí)，樣品吸收度趨于穩(wěn)定。因此，最終確定香草醛－冰醋酸溶液濃度為5%。

2.5.4 高氯酸用量的選擇 按“2.4”項(xiàng)下方法操作，高氯酸加入量分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，測(cè)定吸收度分別為 0.402、0.537、0.541、0.535、0.529。結(jié)果顯示，當(dāng)高氯酸用量為0.6mL時(shí)，吸收度較高，大于0.6mL時(shí)樣品吸收度值不在增加，因此高氯酸的用量確定為0.6mL。

2.6 方法學(xué)的考察

2.6.1 線性范圍試驗(yàn) 精密吸取通關(guān)藤苷D對(duì)照品溶液(濃度0.1608mg/mL)0.10、0.25、0.50、0.75、1.0mL 置于10mL具塞試管中，照“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，在462nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以3次測(cè)定的吸收度的平均值作為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果回歸方程為Y=0.013X －0.009，r=0.9993，本品在16.080μg～160.8μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 分別由三個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)人員，分別在不同日期，按“2.1”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，并按“2.4”項(xiàng)下方法操作。結(jié)果顯示，RSD為1.46%，小于2.0%，精密度符合規(guī)定。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0h時(shí)間間隔內(nèi)，在462nm測(cè)定，吸收度RSD為1.71%。說明供試品溶液顯色后在2.0小時(shí)內(nèi)待測(cè)組分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品6份，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，在462nm測(cè)定吸收度。含量均值為636.9mg/g，RSD為0.87%(n=6)，表明本試驗(yàn)測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.6.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的云南產(chǎn)通關(guān)藤藥材6份各60mg，置錐形瓶中，精密加入對(duì)照品溶液5mL(0.8217 mg/mL)，按照“2.4”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸收度。結(jié)果顯示，本方法總皂苷的回收率在96.87%～102.37%之間，符合有關(guān)規(guī)定，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.6 樣品含量的測(cè)定

精密稱取云南、四川、廣西、成都四個(gè)不同產(chǎn)地的藥材60mg，按“2.1”及“2.4”項(xiàng)下方法操作，照紫外－可見分光光度法(《中國(guó)藥國(guó)》2010版一部附錄VA)在462nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算總皂苷的含量，結(jié)果見表2。測(cè)定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地通關(guān)藤總皂苷的含量有一定差異性，其中云南產(chǎn)藥材的總皂苷含量為最高，這與云南昆明通關(guān)藤為地道藥材相一致，此結(jié)果將對(duì)臨床用藥提供參考。

表2 總皂苷含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 比色法測(cè)定植物中甾體化合物具有顯色靈敏度高、重復(fù)性好，且操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，因此在甾體類成分測(cè)定中占有較為重要的地位。本實(shí)驗(yàn)采用了香草醛－高氯酸法，該方法專屬性強(qiáng)、操作更為簡(jiǎn)便。在少量樣品的測(cè)定時(shí)性質(zhì)還是比較穩(wěn)定的。重復(fù)性、回收率等方法學(xué)考察均符合有關(guān)規(guī)定，可以用于通關(guān)藤總皂苷的含量測(cè)定。

3.2 不同產(chǎn)地通關(guān)藤中總皂苷含量有一定差異性，其中產(chǎn)地云南的含量為最高，這與云南昆明為地道藥材相一致，此結(jié)果將對(duì)臨床用藥提供參考。

［1］邢旺興，陳斌，宓鶴鳴，等．烏骨藤辨考［J］．中藥材，2003，26(7):524－526．

［2］全國(guó)中草藥匯編編寫組．全國(guó)中草藥匯編［M］．第二版．北京:人民衛(wèi)生出版社，1996．

［3］陳紀(jì)軍，張壯鑫，張潤(rùn)珍，等．裂冠牛奶菜的化學(xué)成分［J］．云南植物研究 ，1990，12(1):93．

［4］張慧，翟延君，初正云，等．烏骨藤中五環(huán)三萜類化合物的分離鑒定［J］．分析化學(xué)，2007，35(9):1377－1380．