單于超 郭巧玲 莊銀鳳 田素英

1．廣東省肇慶星湖制藥有限公司，廣東 肇慶 526000;2．廣東省新興中藥學(xué)校，廣東 新興 527400;3．廣東藥學(xué)院中山校區(qū)，廣東 中山 528458

金櫻根為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx的干燥根［1］，為民間常用藥物，具有固精澀腸功效，主要用于治療滑精、遺尿、痢疾泄瀉、崩漏帶下、子宮脫垂、痔疾、燙傷等癥。近年來金櫻根受到較廣泛的應(yīng)用，如婦科千金片、金雞膠囊、廣東涼茶、三金片、三金顆粒等［2］。目前金櫻根用藥部位較混亂，有根、地上莖、地下莖 (陽枝)總鞣質(zhì)含量有所差異，各地所產(chǎn)良莠不一，以致于使金櫻根質(zhì)量不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)對采自湖南、江西、廣西、廣東南雄、潮州、新興和中山七個不同地域的金櫻根、地上莖、陽枝 (產(chǎn)地稱與金櫻根藥材顏色相近地上老莖為陽枝，以下同)的總鞣質(zhì)含量進(jìn)行測定，以便制定金櫻根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，也可更充分地開發(fā)利用金櫻子這一藥用植物。

1 主要材料與儀器

金櫻根、莖藥材 (購于廣東省中山市同心藥業(yè)有限公司，批號:20101013，經(jīng)廣東藥學(xué)院中山校區(qū)田素英副教授鑒定為金櫻子 (Rosa laevigata Michx.)的干燥根、莖);沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110831－200302);干酪素 (上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，批號:20081013);鎢酸鈉 (天津市百世化工有限公司，20090818);鉬酸鈉 (天津市化學(xué)試劑四廠，20041015);硫酸鋰 (天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);丙酮 (天津市富宇精細(xì)化工有限公司);無水碳酸鈉 (江蘇強(qiáng)盛化工有限公司，20081227);鹽酸 (廣州化學(xué)試劑廠);磷酸 (江蘇強(qiáng)盛化工有限公司)等。所用試劑均為分析純。KQ－500型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);UV－1102型紫外－可見分光光度計 (上海天美科學(xué)儀器有限公司);HWS26電熱恒溫水浴鍋 (上海一恒科技儀器有限公司)等。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 制備所用溶液

2.1.1 磷鉬鎢酸試劑的制備 取鎢酸鈉100g，鉬酸鈉25g置圓底燒瓶中，加水700mL使溶解，加鹽酸100mL，磷酸50mL，加熱回流 l0h，放冷，再加硫酸鋰 150g，蒸餾水50mL和溴0.2mL，煮沸除去殘留的溴 (約15min，溶液由棕色漸變?yōu)辄S色)，冷卻，加水稀釋至1000mL，濾過，即得，密封保存待用。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0．0260g，置于50mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，精密量取5.0mL置于100mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液 (每1mL溶液中含沒食子酸0．0260mg)。

2.1.3 待測樣品溶液的制備 稱取7個不同產(chǎn)地金櫻根、地上莖、陽枝粉末各10g，分別置于已貼有對應(yīng)標(biāo)簽的300mL具塞錐形瓶中，加30倍50%的丙酮于超聲波清洗器超聲提取30min后，濾過，用移液管分別吸取2mL濾液置已貼有對應(yīng)標(biāo)簽的100mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 最佳測定波長的選擇

分別取沒食子酸對照品、金櫻根、地上莖、陽枝總酚、不被干酪素吸附的多酚各2mL，分別置于20mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1mL，再分別加蒸餾水10mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。搖勻，放置30min。以相應(yīng)的試劑為空白，在400～900nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，沒食子酸對照品在768nm處有最大吸收，其它比色液均在約768nm具有最大吸收表明沒食子酸、金櫻根鞣質(zhì)顯色后的產(chǎn)物有相同的吸收峰，故以768nm作為測定波長。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL分別置于已貼有相應(yīng)標(biāo)簽的20mL棕色容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試劑 (顯色劑)1mL，然后分別加入蒸餾水 11.5mL、11mL、10mL、9mL、8mL、7mL、6mL。用29%碳酸鈉溶液稀釋 (緩沖劑，堿化溶液)至刻度，搖勻，靜置30min，以相應(yīng)試劑為空白，在768nm的波長處測定吸光度，以吸光度 (A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制沒食子酸吸光度－濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為 Y=0.1332X+0.1088，相關(guān)系數(shù) r=0.9991，表明沒食子酸在0.00065～0.0078mg·mL－1線性關(guān)系良好。

2.4 樣品鞣質(zhì)含量測定［3］

總酚含量測定:精密量取金櫻根、地上莖、陽枝各供試品溶液1.0mL，置相對應(yīng)的20mL棕色容量瓶中，按“2.3”測定各供試溶液總酚吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出濃度，再根據(jù)稀釋倍數(shù)換算即可求得金櫻根總酚的含量。

不被干酪素吸附多酚含量測定:精密量取金櫻根、地上莖、陽枝各供試品溶液25mL加至已經(jīng)盛有干酪素0.6g的100mL具塞的錐形瓶中，塞密，至30℃水浴中恒溫1h，時時振搖，取出、放冷、搖勻、過濾。精密量取濾液3.0mL置相對應(yīng)的20mL棕色容量瓶中，按“2.3”測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出濃度，再根據(jù)稀釋倍數(shù)換算即可求得個各個產(chǎn)地金櫻根、陽枝不被干酪素吸附多酚的含量 (結(jié)果見表1)。以下式計算鞣質(zhì)含量:

鞣質(zhì)含量=總酚含量－不被吸收的多酚含量

表1 不同產(chǎn)地金櫻根、地上莖、陽枝鞣質(zhì)含量的測定

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一沒食子酸對照品溶液2mL置20mL棕色容量瓶中，按“2.3”連續(xù)測定其吸光度A，重復(fù)5次，結(jié)果RSD為0.24%，表明該測定方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一沒食子酸對照品溶液10mL置100mL棕色容量瓶中，按“2.3”在1h內(nèi)每隔10min測定其吸光度A，結(jié)果RSD為0.36%。實(shí)驗(yàn)表明，標(biāo)準(zhǔn)品在1h內(nèi)是穩(wěn)定的，同時發(fā)現(xiàn)其后30min比前30min更加穩(wěn)定，因此有必要進(jìn)行30min的顯色反應(yīng)，保證結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

分別稱取同一產(chǎn)地 (新興)金櫻根樣品5份，每份10g，按“2.1.3”法制備供試品溶液，按“2.3”吸光度測定。結(jié)果總酚RSD0.79%，不被吸附多酚2.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的金櫻根 (新興)粉末10g(6份)，按“2.1.3”法制備供試品溶液。精密稱取0.0066g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，置100mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別移取以上樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.5mL置相對應(yīng)的20mL棕色容量瓶中 (6份)，按“2.3”測定吸光度，計算回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 回收率試驗(yàn)考查結(jié)果 (n=6)

3 討論

溫度過高鞣質(zhì)不穩(wěn)定，本次水浴溫度控制在30℃。根據(jù)前期的正交實(shí)驗(yàn)，確定金櫻根鞣質(zhì)最佳提取工藝為50%的丙酮溶液，30倍溶劑用量，超聲波法提取金櫻根粉末(過三號篩)30min，所以本次實(shí)驗(yàn)采用此提取條件。

鞣質(zhì)含量測定的方法主要有皮粉法、比色法、高錳酸鉀法、絡(luò)合滴定法、干酪素法、分光光度法等。磷鉬鎢酸－干酪素比色法與原來的皮粉法比較具有樣品取量少、靈敏、快速、操作簡便、成本低廉、方便實(shí)用、精密度高、對總鞣質(zhì)專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)。但本方法中，鞣質(zhì)含有的多酚羥基與磷鉬鎢酸試液反應(yīng)生成的藍(lán)色產(chǎn)物遇光不穩(wěn)定，因此顯色反應(yīng)應(yīng)該避光操作，使用棕色容器。其中，鞣質(zhì)的含量與顏色的深度成正比，所含鞣質(zhì)越高，顏色越深，因此，應(yīng)調(diào)整好樣品溶液的加入量，使最終測量時吸光度盡量落在0.2～0.7之間，保證較高的靈敏度，使結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。

當(dāng)前市場有金櫻根、莖混用現(xiàn)象。鐘小清等在《金櫻根藥材的名實(shí)考證》中指出產(chǎn)地將金櫻根陽枝 (產(chǎn)地稱與金櫻根藥材顏色相近老莖為陽枝)作為一個副產(chǎn)品加以開發(fā)利用。由此看來，金櫻陽枝與根應(yīng)該有相近的功效，所謂的金櫻莖代替金櫻根混入市場也源于此。本實(shí)驗(yàn)選用七個不同產(chǎn)地的金櫻根、地上莖、陽枝進(jìn)行鞣質(zhì)含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若以鞣質(zhì)作為主要成分的臨床用藥，金櫻子陽枝與根的鞣質(zhì)含量平均相近，陽枝可替代金櫻根應(yīng)用于臨床，而金櫻子莖鞣質(zhì)含量明顯低于金櫻根，不應(yīng)混入金櫻根中入藥。

從測量結(jié)果還可以發(fā)現(xiàn)，由于地域不同，同一用藥部位鞣質(zhì)含量也有較大的差異，在該次實(shí)驗(yàn)中，各個產(chǎn)地金櫻根鞣質(zhì)含量從大到小排列為廣西＞中山＞新興＞湖南＞潮州＞江西＞南雄，且最大相差幅度為6.69%，平均含量為7.47%，考慮實(shí)驗(yàn)因素，金櫻根鞣質(zhì)最低含量不應(yīng)低于8%。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典 (一部)［S］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:附錄23．

［2］劉佩沂，田素英，梅全喜．金櫻根研究進(jìn)展［J］．海峽藥學(xué)，2010，22(1):98－100．

［3］王克英，左宏笛，楊理明．紫外分光光度法測定石榴皮中總鞣質(zhì)含量［J］．貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，29(6):66－67．

［4］鐘小清，呂高榮，鄒節(jié)明．金櫻根藥材的名實(shí)考證［J］．中草藥，2009，40(7):1140－1143．