王恩軍 季文琦 靳 祎 柴廣軍 王 哲 王 靜

1．河北大學，河北 保定 071000;2．河北省保定市高陽縣醫(yī)院，河北 高陽 0715000;3．河北省保定市第二醫(yī)院，河北 保定 071000;4．河北省保定市一中分校，河北 保定 071000

山茱萸中含有揮發(fā)油、糖類、有機酸類、酯類等多種化學成分，具有良好的應用價值和開發(fā)前景［1］。本試驗采用人肺癌A549細胞作為試驗模型，研究山茱萸水、醇提取物體外抗肺癌活性，為研發(fā)山茱萸的抗癌活性成分提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 ①山茱萸:原生藥從河北安國縣藥材公司購買;②人肺癌A549細胞:由河北農(nóng)業(yè)大學生命科學院提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 山茱萸提取物的制備

1.2.1.1 醇提取物的制備 稱取山茱萸樣品500g，按1:6的比例 (W/V)加入3000mL75%(v/v)乙醇浸泡過夜，回流提取兩次，每次2h。合并兩次提取液抽濾，棄去濾渣，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入5倍量的蒸餾水沉淀除去水不溶性雜質(zhì)，抽濾，濾液冷凍干燥得到山茱萸醇提取物，實驗前用生理鹽水稀釋成合適濃度，濾器除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 水提取物的制備 稱取山茱萸樣品500g，加蒸餾水3000 mL浸泡過夜，100℃水浴1 h，抽濾除去不溶物質(zhì)，真空減壓蒸餾至少量，冷凍干燥得山茱萸水提取物，實驗前用生理鹽水稀釋成合適濃度，濾器除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MTT法檢測山茱萸提取物對A549細胞增殖的影響試驗方法見文獻［2］，試驗分三組:陰性對照組加入生理鹽水，陽性對照組加入順鉑 (20μg/mL)，實驗組加入不同濃度的山茱萸水、醇提取物，計算細胞增殖的抑制率及半數(shù)抑制率 (IC50)。

1.2.3 形態(tài)學觀察 取5×104個/mL的A549細胞接種于48孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，實驗組加入80 mg/mL的山茱萸水、醇提取物，對照組加入生理鹽水，培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 山茱萸提取物對A549細胞增殖的影響

2.1.1 A549細胞經(jīng)不同濃度的山茱萸水、醇提取物作用48 h后，顯示出不同的抑制作用，同一濃度的水提取物抑制作用強于醇提取物，并且在一定范圍內(nèi)抑制作用與濃度成正相關(guān) (P＜0.05)(表1)。

2.1.2 山茱萸提取物對A549細胞的IC50(48 h)［3］通過A549細胞的生長曲線可以得出水提取物的IC50約為57 mg/mL，醇提取物的IC50約為214 mg/mL，由此可見水提取物抑制A549細胞生長的作用更強，敏感性更好。

2.2 形態(tài)學觀察 對照組A549細胞為長梭形或多角形，排列不規(guī)則，細胞邊緣清晰，隱約可見胞核圓形，位于中央;A549細胞經(jīng)山茱萸水、醇提取物處理后，細胞數(shù)量減少，逐漸變?yōu)閳A形，體積縮小，細胞間隙增大，培養(yǎng)液中可見許多漂浮碎片，水提取物作用的A549細胞密度更為稀疏。

表1 不同濃度的山茱萸提取物對A549細胞增殖的抑制作用

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)山茱萸具有免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、抗血小板聚集、抗菌等多種藥理活性［4］，在抗癌方面山茱萸對腫瘤細胞有明顯的抑制作用［5－7］。本文使用人肺腺癌A549細胞作為受試細胞株，采用MTT法比較不同濃度的山茱萸水提取物和醇提取物對細胞的抑制作用。結(jié)果表明:不同濃度的山茱萸提取物對A549細胞都有一定程度的抑制作用，同一濃度下，山茱萸水提取物的抑制作用更明顯;形態(tài)學觀察顯示山茱萸水、醇提取物作用于細胞后均可見到較為典型的細胞凋亡變化。

［1］張聰，金德莊．山茱萸的研究進展［J］．上海醫(yī)藥，2008，29(10):464－467．

［2］司徒鎮(zhèn)強，吳軍正．細胞培養(yǎng)［M］．西安:世界圖書出版公司，2004，25－43，44－57，84－89，251－291．

［3］趙斌，葛金芳，朱娟娟等．小議在MTT法測細胞增殖抑制率中IC50的計算方法［J］．安徽醫(yī)藥，2007，11(9):834．

［4］中藥誘導腫瘤細胞凋亡研究進展［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2004，10(4):331－333．

［5］張?zhí)m桐，袁志芳，杜英峰等．山茱萸的研究近況及開發(fā)前景［J］．中草藥，2004，35(8):952－955．

［6］劉洪，許惠琴．山茱萸及其主要成分的藥理學研究進展［J］．南京中醫(yī)藥大學學報，2003，19(4):254－256．

［7］季宇彬主編．中藥多糖的化學與藥理［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2005，226－230．