西安市中心醫(yī)院 (西安 710004)張 琳 徐 曦 譚 敬 肖新莉 馬 勇

低氧誘導(dǎo)因子 -1 α(Hypoxia inducible factor-lα,HIF- lα)是低氧應(yīng)答過(guò)程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子,具有促進(jìn)無(wú)氧代謝,血管形成,血管擴(kuò)張及紅細(xì)胞攜氧的作用。 HIF- lα對(duì)腦缺血缺氧損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制為改善腦缺血后的能量代謝障礙,促進(jìn)血液動(dòng)力學(xué)恢復(fù),抑制興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性,減少細(xì)胞凋亡等[1,2]。但是一些研究也發(fā)現(xiàn),HIF-lα過(guò)度表達(dá)使細(xì)胞內(nèi) P53水平增加,促進(jìn) Caspases 3的激活表達(dá),導(dǎo)致神經(jīng)毒性從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。本研究旨在觀察腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)期間腦組織中HIF-1 α表達(dá)的時(shí)程和分布特征,以探討腦出血后HIF-1 α表達(dá)的意義,為缺血性腦血管病的治療提供新的途徑。

材料與方法

1 材 料

1.1 動(dòng)物與分組:選用西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康成年雄性昆明小鼠 40只,體重在25～ 30g,由動(dòng)物中心配制的普通小鼠飼料喂養(yǎng),飲用自來(lái)水,分成假手術(shù)組組和腦出血組。腦出血組于術(shù)后7d、14d處死,冰凍切片,用于低氧誘導(dǎo)因子表達(dá)免疫組化測(cè)定,各組 5只。

1.2 藥物與試劑:兔抗小鼠 HIF-1 α抗體(美國(guó)Bioworld,Millipore公司提供),ABC試劑盒(美國(guó)Vector公司提供),羊抗兔抗體、DAB顯色試劑盒(由北京中山公司提供),Ⅳ型膠原酶(美國(guó) Sigma公司提供)。

1.3 儀器:腦立體定位儀為美國(guó) Stoelting公司生產(chǎn),低溫恒冷冰凍切片機(jī)(HM 505E Leica)系德國(guó)萊卡公司生產(chǎn),熒光顯微鏡(Nikon E800)為日本尼康公司生產(chǎn),微量進(jìn)樣器為上海玻璃儀器廠生產(chǎn)。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)性腦出血模型的制作及處理:動(dòng)物經(jīng)10% 水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,俯臥位固定于腦立體定位儀上,前、后囟在同一水平面。在兩耳和兩眼之間皮膚正中線上縱形切開(kāi),暴露前囟。在前囟前 0.5mm,旁開(kāi) 2.5mm處用牙科鉆垂直鉆透顱骨,5 μL微量進(jìn)樣器固定于立體定位儀上,由骨孔緩慢進(jìn)入紋狀體,進(jìn)針深度距顱骨表面 6mm。將Ⅳ型膠原酶 0.075U注入,注射時(shí)間 10min,留針 10min,緩慢退出注射器,骨蠟封閉骨孔,縫合頭皮。術(shù)后觀察動(dòng)物至清醒后,歸籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組動(dòng)物在同位置注入等量生理鹽水。

2.2 行為學(xué)觀察:采用 Berderson評(píng)分法[4]。輕抓尾巴,提起大鼠高于桌面 10 cm,正常大鼠前爪伸直。0分:沒(méi)有神經(jīng)功能缺損;1分:左側(cè)腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)屈曲,肩內(nèi)收屈曲;2分:上述體征+向左側(cè)阻力下降;3分:活動(dòng)時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈(追尾)。

2.3 組織切片制備和組織學(xué)觀察:所有小鼠麻醉后經(jīng)左心室灌注冰肝素生理鹽水 200 ml和 4%多聚甲醛 400 ml(0.1 M PB,pH 7.4),斷頭取腦,組織塊后固定于 4%多聚甲醛 4℃過(guò)夜,入 30%蔗糖(0.1 M PB,pH 7.4)2～3d至組織塊沉底,液氮驟冷,組織保存于-80℃。切片時(shí)在前囟前 0.4 mm至前囟后1.4 mm范圍,用冰凍切片機(jī)行冠狀切片,片厚40 μ m,切片裱于 APES處理的載玻片上,-30℃保存待用。 HE染色用于組織學(xué)觀察。

2.4 HIF-1 α免疫組織化學(xué)染色:冰凍切片 0.01 M PBS漂洗,滴加正常兔血清封閉非特異性抗原,室溫濕盒孵育 1h,去除血清,滴加一抗,4℃濕盒過(guò)夜,0.01 M PBS漂洗,滴加生物素化二抗,濕盒室溫孵育2h,0.01 M PBS漂洗,ABC室溫孵育 1h,0.01 M PBS漂洗,DAB顯色 5～10min,蒸餾水漂洗,梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片、觀察。

2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù):細(xì)胞計(jì)數(shù)在 Nikon 800顯微鏡高倍視野 400倍下進(jìn)行,圖像顯示于計(jì)算機(jī)顯示屏上。用 IPP(Image pro plus 6.0)醫(yī)學(xué)圖像分析軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野的 HIF-1 α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取均數(shù)為各時(shí)點(diǎn)HIF-1 α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。以細(xì)胞密度(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) /mm2)表示,5張切片的均值代表該小鼠的計(jì)數(shù)結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用 SPSS10.0軟件包進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用方差分析(One-way ANOVA)。

結(jié) 果

1 ICH后組織學(xué)改變:膠原酶注射后 1d可形成穩(wěn)定的血腫,血腫位于紋狀體。在 HE染色切片上,ICH后第 7天,HE染色光鏡下可見(jiàn)出血灶與正常腦組織間有一過(guò)度帶即血腫周圍區(qū),血腫周圍水腫,組織疏松,星形細(xì)胞腫脹,神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死,出血灶周邊毛細(xì)血管增生伴炎細(xì)胞浸潤(rùn),同側(cè)側(cè)腦室受壓、變小(圖 1A);第 14天時(shí)出血灶明顯縮小,血腫周圍大量炎性細(xì)胞 (圖 1B)。

圖1 腦出血組織的 HE染色 (A:ICH后 7d;B:ICH后14d。標(biāo)尺在 B:長(zhǎng)度=2mm)

2 ICH小鼠行為學(xué)改變:Berderson行為學(xué)評(píng)分顯示 ICH后第 7天小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.05),見(jiàn)表 1。

表1 小鼠 ICH后 Berderson行為學(xué)評(píng)分 (±s,分)

表1 小鼠 ICH后 Berderson行為學(xué)評(píng)分 (±s,分)

與假手術(shù)組比較,* P＜0.05

組 別 n 第 7天 第 14天假手術(shù)組 5 0.2±0.4472 0.3333±0.5164腦出血組 5 2.2± 0.8367* 1.8333±0.7528*

圖2 大腦皮質(zhì) HIF-1α蛋白表達(dá)(A:假手術(shù)組 HIF-1α表達(dá);B:ICH后 7d;C:ICH后 14d。 標(biāo)尺在 C:長(zhǎng)度=200 μm)

3 ICH小鼠大腦皮質(zhì) HIF-1 α蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)變化:假手術(shù)組腦組織皮層有極少量表達(dá) HIF-1 α的陽(yáng)性細(xì)胞。 ICH組各時(shí)間點(diǎn) HIF-1 α表達(dá)高于假手術(shù)組(圖 2),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 小鼠 ICH后出血側(cè)大腦皮質(zhì) HIF-1 α陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè) /mm2)

4 ICH小鼠出血灶周圍半暗帶的 HIF-1 α蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)變化:假手術(shù)組紋狀體有極少量表達(dá) HIF-1 α的陽(yáng)性細(xì)胞。 ICH組各時(shí)間點(diǎn) HIF-1 α表達(dá)高于假手術(shù)組(圖 3),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 腦出血灶周圍半暗帶 (紋狀體)的 HIF-lα蛋白表達(dá)

表3 小鼠 ICH后出血灶周半暗帶 HIF-lα陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(個(gè) /mm2)

討 論

小鼠 ICH后存在嚴(yán)重的行為學(xué)障礙,這種障礙在ICH后第 2天最為明顯,在 1～ 4周逐漸恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 ICH后第 7天小鼠依然表現(xiàn)有嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。

HIF-1是一種缺氧誘導(dǎo)的主要轉(zhuǎn)錄因子,含一個(gè)α亞單位和一個(gè)β亞單位,其中 HIF-1 α是可調(diào)控的功能單位,受氧濃度變化的調(diào)節(jié),缺氧后其轉(zhuǎn)錄活性增加。目前認(rèn)為 HIF-1 α可以作為組織缺氧的標(biāo)志[5]。既往研究發(fā)現(xiàn) HIF-1 α上調(diào)后具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。Yuan LB等研究發(fā)現(xiàn) HIF-1 α在缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)中起著重要作用[7,8]。無(wú)論是在全腦缺血、局灶性腦缺血時(shí),腦組織中都發(fā)現(xiàn)有 HIF-1 α的激活。 Wu W等[9]將基因重組的腺病毒 HIF-1 α轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞移植到腦缺血 24h的大鼠側(cè)腦室,腺病毒 HIF-1 α轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞移植組較其他組神經(jīng)功能改善更加明顯,并且發(fā)現(xiàn)改組的缺血損傷區(qū)域第Ⅷ因子陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加,表明 HIF-1 α的表達(dá)可促進(jìn)血管新生。因此,運(yùn)用 HIF-1 α基因治療是缺血性腦損傷治療中的新的途徑。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明在缺氧情況下,HIF-1 α在損傷缺氧區(qū)表達(dá)明顯增加,用于對(duì)缺氧的應(yīng)激,與以往的研究結(jié)果一致。

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