中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染科 (沈陽 110001)崔 巍 孫翠明 劉 沛

sIgA是腸粘膜表面最重要的免疫防御因子,由漿細(xì)胞產(chǎn)生的 Ig A和腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的分泌片(Secretory component,SC)組裝而成,能夠抑制細(xì)菌粘附,在腸道局部免疫中發(fā)揮重要作用。有研究表明腸粘膜局部 sIg A減少是暴發(fā)性肝衰竭、燒傷、膿毒血癥等多種疾病中促進(jìn)細(xì)菌移位,誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征的重要因素[1,2]。谷氨酰胺是目前為止最有效的腸粘膜保護(hù)劑,能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞更新,維持腸上皮細(xì)胞的完整性。近年研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺缺乏可以引起細(xì)菌移位[3],但是具體的作用機(jī)制還不十分清楚,是否與抑制 sIgA的產(chǎn)生有關(guān)目前還沒有報(bào)道。因此本文觀察了谷氨酰胺缺乏對(duì)腸上皮細(xì)胞合成分泌片的影響,以探討谷氨酰胺在腸粘膜局部免疫功能中的作用。

材料與方法

1 材料選擇

1.1 細(xì)胞株:Caco-2細(xì)胞株購自 American Type Culture Collection。

1.2 主要試劑:DM EM高糖培養(yǎng)基、FBS購自美國 GIBCO-BRL公司;非必須氨基酸購自美國 Hyclone公司;L-GLN、小鼠抗 SC多克隆抗體購自美國 Sigma公司;BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司;RNA PCR試劑盒、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real time quantitive PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng):Caco-2細(xì)胞應(yīng)用含有 200 ml/L胎牛血清、10 g/L非必須氨基酸、青霉素-鏈霉素雙抗液和不同濃度的谷氨酰胺(0、0.1、1、4mM)的 DM EM培養(yǎng)液,在 37°C、50 ml/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),每 7 d按 1∶2的比例傳代,傳代后 7 d左右細(xì)胞生長達(dá)到融合,提取細(xì)胞蛋白或總 RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Western blot:應(yīng)用 RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取總蛋白;應(yīng)用 BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量,具體方法按照說明書進(jìn)行。將樣品調(diào)成相同蛋白濃度,沸水煮 5min進(jìn)行蛋白變性;每個(gè)樣本取等量蛋白(約 50 μ g)進(jìn)行 8%SDS-PAGE凝膠電泳 ,電壓 100V,90min;電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,電壓 50V,2h;脫脂奶粉封閉 2h,加入小鼠抗 SC抗體 (1∶1000)4℃過夜;然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠-IgG抗體(1∶3000)室溫 2h,ECL顯色。以β-actin作為內(nèi)參,結(jié)果通過天能圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,SC蛋白含量=樣本 SC蛋白灰度值 /同一樣本β-actin灰度值。

2.3 實(shí)時(shí)定量 PCR(Real time quantitative PCR):用 T RIZOL一步法提取細(xì)胞總 RNA。采用SYBR Green I熒光染料嵌合法檢測(cè) SC mRNA。簡言之先構(gòu)建目的基因(SC基因)和管家基因(GAPDH)的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量。通過管家基因的校正,檢測(cè)各組細(xì)胞樣本中 SC目的基因的相對(duì)表達(dá)量。SC mRNA的相對(duì)表達(dá)量 = SC基因拷貝數(shù) /GAPDH基因拷貝數(shù)。 PCR反應(yīng)體系的組成參照說明書進(jìn)行,反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 42℃10min,95℃2min,PCR擴(kuò)增 95℃ 10 s1個(gè)循環(huán) ,95℃5 s,60℃20s 45個(gè)循環(huán)。

SC和 GAPDH引物序列如下表,SC產(chǎn)物片段89bp,GAPDH產(chǎn)物片段 144bp。

SC-F 5'-TGTTGCCACCACTGAGAGCAC-3'SC-R 5'-CTT TGTAGGCCATCTCGGCTTC-3'GAPDH-F 5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3'GAPDH-R 5'-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3'

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)以 Mean±SD表示,應(yīng)用 SPSS13.0,采用單因素方差分析(AVONA)的 LSD方法對(duì)各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 谷氨酰胺對(duì)腸上皮細(xì)胞 SC蛋白合成的影響(圖 1):在 80 kDa處可見特異性蛋白條帶,對(duì)各條帶進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn):谷氨酰胺缺乏時(shí),SC蛋白的相對(duì)含量為(0.28±0.02),逐漸增加培養(yǎng)液谷氨酰胺濃度后各組 SC蛋白的相對(duì)含量逐漸增加(0.33±0.03,0.88±0.02,1.02±0.03),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示谷氨酰胺的含量能夠影響 Caco-2細(xì)胞 SC蛋白的合成。

圖1 各組 SC蛋白 Western blot結(jié)果:可見隨著 GLN濃度的逐漸增加,SC蛋白的相對(duì)含量增加(*與 GLN 0mM組相比P＜0.05)

2 谷氨酰胺對(duì)腸上皮細(xì)胞 SC m RNA表達(dá)的影響 (圖 2):電泳結(jié)果和 OD值結(jié)果顯示,構(gòu)建的人 SC基因和 GAPDH基因 RNA標(biāo)準(zhǔn)品片段長度分別為342bp和 1043bp。其質(zhì)量良好,所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為 0.998,線性關(guān)系良好,融解曲線顯示特異性良好。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的 SC基因和 GAPDH基因進(jìn)行定量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著谷氨酰胺濃度的增加,SC mRNA的表達(dá)量逐漸上調(diào)(1.0±0.01,1.13±0.06,1.39±0.04,1.48± 0.07),各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示谷氨酰胺的含量能夠影響 Caco-2細(xì)胞 SC mRNA的表達(dá)。

圖2 各組 SC mRNA檢測(cè)結(jié)果:左圖為 SC擴(kuò)增曲線,下圖為定量分析結(jié)果,可見隨著 GLN濃度的增加,SC mRN A的表達(dá)量逐漸上調(diào)(*與 GLN 0mM組相比 P＜0.05)

討 論

1988年 Wilmore等提出“腸道是應(yīng)激的中心器官”學(xué)說,認(rèn)為應(yīng)激時(shí)腸管呈短暫或長時(shí)間的腸屏障功能損害,腸粘膜萎縮、通透性增加,細(xì)菌和毒素穿越腸粘膜屏障移行到腸系膜淋巴結(jié)或其他遠(yuǎn)處臟器形成細(xì)菌易位,促進(jìn)了全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的發(fā)生 ,通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)可最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[4]。

細(xì)菌和毒素穿越腸粘膜屏障必須首先粘附在腸上皮細(xì)胞上,這一過程與腸道局部免疫功能狀態(tài)特別是sIg A密切相關(guān)。sIg A對(duì)腸道菌群尤其是 G-桿菌具有特殊的親和力,能夠包被細(xì)菌,封閉細(xì)菌與腸上皮細(xì)胞結(jié)合的特異部位,阻止其與腸上皮細(xì)胞粘附,避免細(xì)菌通過腸上皮細(xì)胞發(fā)生移位;sIgA還可中和腸道內(nèi)的毒素、酶和病毒,并結(jié)合抗原分子形成免疫復(fù)合物,介導(dǎo)吞噬細(xì)胞清除病原微生物[5],因此 sIg A是維持正常腸粘膜屏障功能的重要環(huán)節(jié)。

GLN是目前最有效的腸粘膜保護(hù)劑,是生物大分子如嘌呤、嘧啶、核酸及蛋白質(zhì)的重要氮和碳的前體,也是合成 ATP的前提,具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制蛋白質(zhì)降解的作用,在維持腸道粘膜代謝、結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮重要作用[6]。既往研究認(rèn)為 GLN主要是通過加快腸上皮細(xì)胞更新速度,減少上皮細(xì)胞凋亡,從而維持完整的腸粘膜機(jī)械屏障來發(fā)揮作用[7,8]。近年來研究表明 GLN對(duì)腸粘膜免疫屏障亦有影響,表現(xiàn)為 GLN缺乏時(shí)腸道細(xì)菌包被率下降,細(xì)菌移位增加,補(bǔ)充GLN可以增加燒傷動(dòng)物腸道局部 sIg A的含量[9],這些研究提示腸道免疫屏障也是 GLN影響腸粘膜屏障功能的一個(gè)重要靶點(diǎn),因此我們應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察了 GLN對(duì)腸上皮細(xì)胞合成 sIgA的重要組成部分—SC的影響。

結(jié)果表明在 GLN缺乏情況下,腸上皮細(xì)胞只能合成較低含量的 SC,增加 GLN濃度到 1mM以上,SC蛋白含量明顯增加。 SC是分泌性免疫系統(tǒng)的重要因子,參與 sIg A的形成和選擇性上皮運(yùn)輸。SC由腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生,與腸粘膜內(nèi) Ig A漿細(xì)胞分泌的聚合 Ig A結(jié)合后由腸上皮細(xì)胞以內(nèi)化的方式攜入胞內(nèi)形成吞飲小泡,再轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞頂端,以胞吐的方式釋放入粘膜腔。結(jié)合的 SC能夠降低 sIgA對(duì)腸腔內(nèi)蛋白酶的敏感性;未結(jié)合的 SC稱為游離 SC,De Araujo等研究發(fā)現(xiàn),游離 SC是抵抗大腸桿菌的重要非特異性防御因素[10]。本研究結(jié)果提示 GLN缺乏時(shí) SC合成減少,導(dǎo)致 sIg A的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)障礙,由 SC介導(dǎo)的非特異性防御因素和分泌性免疫功能受到抑制,腸粘膜免疫屏障缺陷,最終引起細(xì)菌移位;補(bǔ)充 GLN能夠糾正這一損傷,抑制細(xì)菌移位。

機(jī)體調(diào)節(jié)某種蛋白的合成,不外乎在轉(zhuǎn)錄水平或蛋白水平進(jìn)行,為了明確 GLN影響 SC蛋白合成的作用環(huán)節(jié),我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)了不同濃度 GLN對(duì) SC mRNA合成的影響。結(jié)果表明:增加 GLN濃度可以上調(diào) SC mRNA的表達(dá),說明 GLN影響 SC蛋白的合成發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,這為進(jìn)一步研究 GLN影響 SC蛋白合成的信號(hào)通路提供基礎(chǔ)。

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