鄭華生 鄭迪楠 李劍民 林旸 蔡鑾端 鄭睦暢

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus,HPV）目前已確定HPV型別大約有100多種，約40余種可感染婦女生殖道，約20余種與腫瘤相關(guān)，不同型別的生物學(xué)行為及致病能力各不相同,根據(jù)不同型號(hào)HPV與腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性高低,分為低危險(xiǎn)型和高危險(xiǎn)型，高危型HPV(與宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤病變有關(guān))包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68,共13種亞型;低危型HPV(與外生殖器尖銳濕疣等良性病變有關(guān))包括HPV6、11、42、43、44,共5種亞型[1]。HPV感染女性生殖器引起尖銳濕疣近年來(lái)發(fā)病率不斷增高，是國(guó)家目前重點(diǎn)監(jiān)測(cè)和防治的性傳播疾病之一。尖銳濕疣又極易復(fù)發(fā)，一個(gè)重要原因是亞臨床和潛伏感染未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療。大量資料顯示，女性宮頸的HPV感染相當(dāng)常見(jiàn)，而高危險(xiǎn)型HPV隱性感染長(zhǎng)期存在，為宮頸癌、外陰癌重要原因。我們于2009年3月～2010年5月用前瞻性研究方法，采用PCP擴(kuò)增快速導(dǎo)流雜交技術(shù)，對(duì)汕頭市澄海區(qū)部分事業(yè)單位2663例女職工進(jìn)行HPV感染情況普查和檢測(cè)分型，現(xiàn)將其結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 汕頭市澄海區(qū)部分事業(yè)單位有性生活史的普通女性共2663人,年齡最大59歲，最小22歲，平均40.7歲

1.2 方法

1.2.1 做好宣傳發(fā)動(dòng)工作，印發(fā)檢查須知：①檢查前24h內(nèi)不應(yīng)有性行為。②避開(kāi)月經(jīng)期，月經(jīng)干凈后3d。③停止陰道沖洗和用藥3d。④注意陰道、外陰衛(wèi)生。

1.2.2 主要儀器和試劑及原理

7300PCR擴(kuò)增儀、Hybri Max醫(yī)用核酸分子快速雜交儀(HCⅡ)（由廣東凱普生物科技有限公司提供），HPV擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒。試劑用凱普HPV DNA抽提試劑盒及核酸分子快速雜交基因分型試劑盒進(jìn)行病毒基因分型，采用低密度基因芯片和導(dǎo)流雜交技術(shù)，原理是先將病毒的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，再利用核酸分子快速導(dǎo)流雜交技術(shù)，使目的分子導(dǎo)流穿過(guò)固定有DNA探針的低密度基因芯片薄膜上，而發(fā)生快速雜交。一次性快速檢測(cè)中國(guó)人群HPV95%的21種亞型，即13種高危險(xiǎn)型（H PV16.18.31.33.35.39.45.51.52.56.58.59.68），5種低危險(xiǎn)型（HPV6.11.42.43.44）和3種未分高低危亞型(HPV53、66、CP8304)。

1.3 標(biāo)本采集

取檢醫(yī)生用窺陰器暴露宮頸，用宮頸刷在宮頸口稍用力順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈，取宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，然后放入裝有專用細(xì)胞保存液的試管中，于4℃保存，1周內(nèi)檢測(cè)。

1.4 試驗(yàn)步驟

1.4.1 DNA的提取 將宮頸細(xì)胞保存液充分震蕩混勻，取800μl保存液以14000r/min離心5min，棄上清液，用DNA提取試劑盒按步說(shuō)明書(shū)進(jìn)行取標(biāo)本DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 取1μl樣品做PCR擴(kuò)增,采用HPV通用引物，引物序列5’端標(biāo)記生物素做標(biāo)記，PCR反應(yīng)體系：將23.5μl PCR-MIX、0.75μl Taq酶和1μl DNA模板混勻，設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)條件如下：50℃ 10min，95℃ 9min；（95℃20sec、55℃ 30sec、72℃ 30sec）共40個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。

1.4.3 雜交和顯色 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行95℃ 5min，快速放入冰浴3min，取0.5μl加入500μl雜交液中，在雜交膜上反應(yīng)10min，加封阻液反應(yīng)5min，用酶標(biāo)液洗2次，加顯色劑顯色。

1.4.4 結(jié)果判斷 肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性為藍(lán)紫色圓點(diǎn)，根據(jù)雜交膜探針?lè)植嫉奈恢?，判斷?yáng)性點(diǎn)為何種HPV亞型，多個(gè)圓點(diǎn)即為多重感染，每次雜交試驗(yàn)均設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用x2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t驗(yàn)檢，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV陽(yáng)性結(jié)果

用HybriMax導(dǎo)流技術(shù)檢測(cè)2663例女性宮頸標(biāo)本HPV DNA,共檢出214例陽(yáng)性，總感染率為8.04%，亞型陽(yáng)性244例，其中高危中高危險(xiǎn)型別HPV198例，占亞型總數(shù)的81.15%，低危險(xiǎn)型別18例。占亞型總數(shù)的7.38%，未分高低危亞型(HPV53、66、CP8304)28例，占亞型總數(shù)的11.48%。在214例陽(yáng)性結(jié)果中，單一亞型感染者187例，占87.38%，混合亞型27例、占12.62%，最多是3種亞型混合感染有3例。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 244例HPV陽(yáng)性高低危亞型的構(gòu)成比

2.2 HPV陽(yáng)性的亞型分布

214例女性檢出244例HPV亞型中，陽(yáng)性比率最高3個(gè)是HPV52（27.8%）、HPV16（18.85%）、HPV58(12.3%)，依次是HPV33(7.38)、CP8304(6.97%)、HPV18(4.10%)，其中HPV43、HPV51、HPV56未檢出，詳見(jiàn)表2。

表2 244例HPV陽(yáng)性的亞型分布情況

2.3 HPV感染者的年齡分布

被檢查的2663例女性中，年齡最大60歲，最小22歲，平均40.7歲,總共檢出HPV陽(yáng)性214例在各個(gè)年齡段分布有所不同，檢出率最高為31～40歲（11.62%），檢出率最低為21～30歲（4.65%），但各組年齡段的檢出率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無(wú)顯著性（P＞0.05），具體分布情況見(jiàn)表3。

表3 2663 例婦女的年齡分布和HPV陽(yáng)性率的情況

3 討論

人類乳頭瘤病毒（HPV）是無(wú)包膜、20面體對(duì)稱病毒，基因組為閉合環(huán)狀DNA，長(zhǎng)度在7200～8000bp之間，它具有鱗狀上皮細(xì)胞的親嗜性，生活周期包含早期和晚期2個(gè)階段，分化過(guò)程中的鱗狀上皮細(xì)胞提供了HPV復(fù)制、病毒衣殼蛋白合成和病毒粒子包裝所必需的內(nèi)環(huán)境[2]。HPV感染可能的致病機(jī)制是在機(jī)體免疫力低下時(shí)整合到機(jī)體的核染色體基因組上，導(dǎo)致p53基因失活、不能正常表達(dá)，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)失控[3]。隨著HPV研究的深入，單基因功能闡釋已經(jīng)比較透徹，為治療HPV感染提供了理論基礎(chǔ)。我們用HybrMax法來(lái)檢測(cè)HPV,是導(dǎo)流雜交技術(shù)和低密度基因芯片技術(shù)的結(jié)合，利用PCR擴(kuò)增提高檢測(cè)的靈敏度，分子雜交的特異性高。運(yùn)用它的高通量的特點(diǎn)可以一次性檢測(cè)HPV的21種亞型，大大地提高分型和檢測(cè)率，凱普公司的這種方法有良好的質(zhì)控體系，包括陰性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照和biotin對(duì)點(diǎn)，對(duì)基因擴(kuò)增和雜交全程控制，整個(gè)過(guò)程僅3.5h，結(jié)果準(zhǔn)確快捷。

3.1 有關(guān)HPV感染率

由于檢測(cè)的對(duì)象、采用的檢測(cè)技術(shù)以及研究的地區(qū)、人群的不同，各國(guó)各地區(qū)報(bào)道的HPV感染率高低不一，本組檢測(cè)結(jié)果HPV感染率為8.03%，與對(duì)深圳某銀行系統(tǒng)的1276名女性員工進(jìn)行HPV檢查的陽(yáng)性率為7.37%[4]相接近，比吳春龍等報(bào)導(dǎo)的臺(tái)州地區(qū)女性HPV感染陽(yáng)性率20.8%[5]、張?jiān)伱返葓?bào)導(dǎo)的湘潭地區(qū)陽(yáng)性率21.79%[6]低。感染率的高低，除了地區(qū)差異，可能主要是檢查對(duì)象不同，后2組對(duì)象都是婦科門診病人，而我們檢查對(duì)象是事業(yè)單位女職工。但這可以看出，女性感染HPV是很常見(jiàn)，如果被檢人群是懷疑宮頸癌或生殖器疣患者，感染率會(huì)很高，國(guó)際宮頸癌生物學(xué)研究（IBSCC）機(jī)構(gòu)對(duì)HPV感染與宮頸癌的相關(guān)性進(jìn)行大樣本統(tǒng)計(jì)后報(bào)道，93%以上的宮頸癌組織中可檢出HPV，表明了HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌的重要原因[4]。因此應(yīng)加強(qiáng)女性HPV感染的檢查和監(jiān)測(cè)，對(duì)生殖器疣、宮頸癌的防治有重要臨床意義。

3.2 HPV感染與年齡的關(guān)系

本組檢測(cè)結(jié)果中，感染率最高組年齡段為31～40歲（11.62%），依次是51～60歲（8.97%）、41～50歲（5.91%）、21～30歲感染率較低為4.65%，但各組年齡段的檢出率差異無(wú)顯著性（P＞0.05），感染率最高的年齡組和各組年齡段的檢出率差異無(wú)顯著性與深圳白領(lǐng)女性調(diào)查[4]和湘潭地區(qū)[6]相似，與臺(tái)州地區(qū)[5]的隨年齡增大而感染率增高以及各組年齡段的檢出率差異有顯著性不同。

3.3 HPV感染的亞型分布與防治策略

HPV感染存在多樣性和地區(qū)性差異，各國(guó)各地區(qū)型別有所不同，國(guó)際癌癥研究協(xié)會(huì)（IARC）的研究顯示，最常見(jiàn)的亞型為HPV16、18，而HPV45在非洲相對(duì)較多，HPV33則主要集中在歐洲，亞洲國(guó)家則以HPV52、58常見(jiàn)。本組檢測(cè)結(jié)果中，高危險(xiǎn)型HPV占81.15%，低危險(xiǎn)型占7.38%，中國(guó)人常見(jiàn)亞型(HPV53、66、CP8304)占11.48%；亞型中以HPV52為第一位，依次是HPV16、HPV58，與江雨等[7]報(bào)導(dǎo)的閩南地區(qū)前3位分別是HPV52、58、16和湘潭地區(qū)[3]前3位HPV16、52、58相類似，但稍有差異。

了解本地區(qū)的亞型情況對(duì)今后防治有重要指導(dǎo)作用，目前疫苗預(yù)防HPV感染的宮頸癌效果顯著，2006年美國(guó)默克公司研制的名為“加德而”的疫苗，對(duì)預(yù)防引起約70%宮頸癌的HPV16.18型及引起約90%生殖器疣的HPV6.11型感染很有效。目前上市的疫苗均為二價(jià)疫苗（16/18）或四價(jià)疫苗（16/18/6/11），沒(méi)有涵蓋排在本地區(qū)感染率高居第1、3位的HPV-52、58這2個(gè)亞型，因此，針對(duì)我國(guó)和本地區(qū)不同亞型的疫苗研究，將是預(yù)防HPV感染和致病的一個(gè)重要方向。由此可見(jiàn)，了解本地區(qū)的流行病情況，能提供制訂科學(xué)的干預(yù)措施，盡快阻斷HPV感染的傳播，降低HPV感染的發(fā)生率、發(fā)病率，重點(diǎn)是對(duì)高危HPV感染的人群干預(yù)，積極監(jiān)測(cè)、隨訪，定期復(fù)查和合理的治療。目前，我們用這種凱普PCP擴(kuò)增快速導(dǎo)流雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)女性HPV感染和分型的方法，快捷準(zhǔn)確，對(duì)本地區(qū)女性生殖道腫瘤（特別是宮頸癌）和生殖器疣的防治具有重要臨床意義。

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