李燕 遲瑩 卞倩 溫恬 張文帥 焦永軍

流行性感冒(流感)是一種最常見的病毒性急性呼吸道傳染病，至今無法完全加以控制［1－2］，流感給個人和社會帶來的經(jīng)濟損失始終列于各傳染病之首。流感傳染性強，尤其在老年人中有很高的發(fā)病率，并易導致肺炎等嚴重并發(fā)癥，甚至死亡［3－4］。其病原為流行性感冒病毒(流感病毒)，屬于正粘病毒科，分甲、乙、丙3個型別，其中甲型流感病毒的致病力最強［5－6］。近年來，由于甲型流感多次引起大規(guī)模的世界性流行，已引起了研究者們的高度關注［7－9］。2009年3月起美國、墨西哥出現(xiàn)A/H1NI流感(我國稱甲型H1N1流感)病例并形成疫情，以后迅速蔓延，疫情擴大到100多個國家或地區(qū)，呈全球蔓延態(tài)勢［10－11］。

流感病毒表面血凝素(hemagglutinin，HA)是流感病毒合成的重要蛋白［12］。HA在流感病毒的致病過程中有重要作用，同時 HA和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的差異是甲型流感病毒(influenza virus A)亞型劃分的主要依據(jù)［13］。在動物體內(nèi)由于免疫力的作用，流感病毒HA基因非常容易發(fā)生抗原漂移，導致待測病毒與標準檢測抗體的交叉反應性差，給檢測及防治工作帶來許多困難。因此，人工表達HA蛋白，對流感的快速準確檢測以及制備基因工程疫苗具有重要的應用價值。而HA1是HA基因的高度保守區(qū)域［14－15］，HA 蛋白具有6 個糖基化位點，其中5個N糖基化位點位于HA1上，HA1上的一些區(qū)域表現(xiàn)出很強的抗原特性，HA1蛋白的表達與純化對流感的快速準確檢測以及制備基因工程疫苗具有重要意義，因此，本研究旨在為進一步制備快速診斷試劑及開發(fā)基因工程疫苗，構(gòu)建了甲型SWH1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的桿狀病毒真核表達載體，轉(zhuǎn)染sf 9細胞表達并純化其編碼蛋白。

1 材料和方法

1.1 病毒毒株、質(zhì)粒及細胞 江蘇甲型SWH1N1流感病毒毒株［A/Jiangsu/1/2009(H1N1)］、DH10Bac、大腸桿菌E.coli TOP10感受態(tài)細胞及sf 9細胞為江蘇省疾病預防控制中心病原生物所保存。

1.2 試劑 PCR試劑盒(Qiagen公司)、膠回收試劑盒(Omega公司);Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Xhol 1 及 Bgl 2、DNA 連接酶試劑盒、pMD18－T Simple Vector試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、RNA提取試劑盒(TaKaRa 公司);Lipofectamine2000、Opti－MEM(Invitrogen 公司);DMEM－1000(Gibco 公司);anti－His antibody(abcam公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 流感病毒總RNA的提取 參照試劑盒使用說明提取流感病毒總RNA。

1.4 引物設計 根據(jù)甲型SWH1N1流感病毒HA1基因序列［A/Jiangsu/1/2009(H1N1)］，設計上下游引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列如 下:上 游 引 物 5'－GG GAATTCCTATGAAGGCAATACTAGTA－3';下 游 引 物 5'－AG CTCGAGGC TAGGCCTCTAGATTGAAT－3'。引物序列下劃線為酶切位點，分別是 EcoR1(GGATCC)和 Xhol 1(CTCGAG)。預期擴增產(chǎn)物為HA1基因，片段長度約為1038 bp。

1.5 RT－PCR擴增甲型SWH1N1流感病毒HA1基因以提取的流感病毒總RNA為模板，一步法擴增HA1全長基因，RT－PCR體系參照試劑盒使用說明。RTPCR反應條件為:50℃ 30 min，95℃變性15 min，然后94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 真核表達體系 HA1－p－fast質(zhì)粒的構(gòu)建 EcoR1和Xhol1分別雙酶切陽性HA1 PCR產(chǎn)物與p－fast質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后連接酶切產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10F'感受態(tài)細胞，涂板后挑取單個菌落培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒進行 PCR及酶切鑒定，鑒定為陽性的重組載體進行基因測序分析，測序正確的質(zhì)粒命名為 HA1－p－fast。

1.7 轉(zhuǎn)座構(gòu)建桿狀病毒HA1－Bacmid 取測序正確的HA1－p－fast質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH10Bac 細胞，涂板(平板含:50 μg/ml kana、7 μg/ml的 genta、10 μg/ml tet、100 μg/ml Bluo－gal、40 μg/ml IPTG)，倒置培養(yǎng) 48 h，挑取白斑培養(yǎng)擴增(含:50 μg/ml kana、7 μg/ml的 genta、10 μg/ml tet)，菌液經(jīng)M13和HA1雙重PCR鑒定，提取陽性質(zhì)粒，命名為 HA1－Bacmid。

1.8 重組表達HA1蛋白 sf9細胞常規(guī)接種于6孔板中，使用含10%胎牛血清的Grace's完全昆蟲培養(yǎng)基，27℃，無CO2條件下培養(yǎng)，待細胞密度達70%～80%后進行轉(zhuǎn)染。Bacmid DNA用的Grace's昆蟲培養(yǎng)基(無添加劑、無血清)稀釋混勻后置室溫作用5 min，在另一管中將脂質(zhì)體LipofectamineTM2000與Grace's培養(yǎng)基稀釋混勻室溫作用5 min，將稀釋的質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體培養(yǎng)液混勻，室溫孵育30 min。將混合物加入到培養(yǎng)板中。培養(yǎng)4～6 h，換成Grace's完全昆蟲培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5 d左右，觀察細胞病變情況，待細胞70%以上出現(xiàn)病變后檢測HA1蛋白的表達。收取HA1蛋白表達陽性的P1代細胞上清，依次感染P2、P3代細胞，以獲得大量的HA1蛋白。

1.9 重組HA1蛋白的純化 收集細胞，4℃ 7000～8000 g離心10 min，收集細胞沉淀，冰水中超聲破碎細胞，破碎液4℃ 12 000 g離心10 min，加20 mmol/L咪唑溶液，過0.45 μm的濾膜，取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF預裝柱，用10 ml平衡緩沖液(pH 7.4的50 mmol/L磷酸緩沖液，含 0.5 mol/L NaCl，8 mol/L 脲素，20 mmol/L咪唑)平衡，上樣，洗滌，用5 ml洗脫緩沖液洗(pH 7.4的50 mmol/L磷酸緩沖液含0.5 mol/L NaCl，8 mol/L脲素，含500 mmol/L咪唑)洗脫吸附的樣品，流速1～2 ml/min，2 ml/管收集。

1.10 免疫印跡鑒定表達 純化蛋白SDS－PAGE蛋白電泳后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉。一抗為1∶500過氧化物酶標記的抗HIS多克隆抗體，4℃孵育過夜。用增強化學發(fā)光蛋白免疫印跡法(ECL)進行Western blot顯色分析。

2 結(jié)果

2.1 HA1基因的鑒定 HA1基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1000 bp處可見單一特異性條帶，大小與HA1基因理論值一致，見圖1。

圖1 HA1基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析

2.2 HA1－p－fast質(zhì)粒的鑒定 通過T4連接酶將EcoR1和Xhol1雙酶切的陽性HA1 PCR產(chǎn)物與p－fast載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，挑5個單克隆進行特異性HA1引物PCR鑒定，結(jié)果均為陽性(圖2)。取其中1個陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒，EcoR1和Xhol1雙酶切，同時用HA1引物PCR鑒定，電泳鑒定雙酶切及PCR均有約1000 bp左右的目的帶(圖3)，結(jié)果表明HA1基因片段正確克隆到載體p－fast上。

2.3 HA1－Bacmid的鑒定 取測序正確的 HA1－p－fast質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac細胞，涂板，培養(yǎng)后挑取5個陽性克隆，搖菌，菌液經(jīng)HA1的特異性引物和M13的通用引物PCR鑒定，電泳鑒定雙酶切及PCR均有約1000 bp左右的目的條帶(圖4)。結(jié)果表明已獲得正確的HA1－Bacmid。

圖4 HA1－Bacmid瓊脂糖電泳分析

2.4 Western blot鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果 轉(zhuǎn)染HA1－Bacmid的P1代sf9細胞表達的重組蛋白可以被抗His抗體所特異性識別，其大小與預期相同，同時空載體組與空白對照組無條帶，表明HA1在sf 9細胞中得到表達(圖5)。

圖5 Western印跡法檢測HA1－Bacmid在sf9細胞的表達

2.5 重組蛋白的純化鑒定 采用親和層析方法，特異性結(jié)合分離HA1蛋白，收集純化后的蛋白，SDS凝膠電泳，考染后掃描分析目的蛋白的純度為90%左右(圖6)。

圖6 SDS凝膠電泳法檢測HA1蛋白的純化

3 討論

流感病毒的危害性極大，全世界平均每年有50萬～100萬人死于流感［16］。流感傳染性強，尤其在≥60歲的老年人中有很高的發(fā)病率，并易導致肺炎等嚴重并發(fā)癥，甚至死亡。流感病毒是致流感的主要病原體。流感病毒屬正粘病毒科，基因組為分節(jié)段負鏈RNA。甲型流感病毒根據(jù)HA和NA抗原性的不同，HA可以分為16個亞型，NA分為9個亞型［17］。H1N1亞型流感病毒和其他甲型流感病毒一樣，其HA基因中的HA1基因變異決定了其抗原性特點，其變異與流感的流行及流行規(guī)模的大小密切相關［18］。同時，HA1是各亞型流感之間HA差異的主要區(qū)域，具有型特異性。用HA1蛋白作為檢測抗原，從理論上講應該能夠區(qū)別其他亞型的特點，同時降低鑒別診斷的假陽性率。

桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)是真核表達系統(tǒng)中應用廣泛的一類表達系統(tǒng)，有很多優(yōu)點，具有與大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉(zhuǎn)譯外源蛋白的能力，表達的蛋白具有良好的生物學活性，表達水平高;同時，作為表達載體的桿狀病毒，其自身的蛋白在哺乳動物體內(nèi)也沒有相應的抗體，因此與哺乳動物的交叉反應?。?9］;此外，利用桿狀病毒昆蟲系統(tǒng)表達的HA1蛋白具有良好的血凝活性，而原核系統(tǒng)表達的HA1蛋白則不具有這一特性。

本研究用RT－PCR法獲得甲型H1N1流感病毒血凝素HA1基因序列，然后將其與p－fast質(zhì)粒連接，通過PCR擴增、酶切和序列測定證實重組質(zhì)粒構(gòu)建正確;取測序正確的 HA1－p－fast質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH10Bac，再次鑒定，獲得正確的HA1－Bacmid;感染桿狀病毒sf9昆蟲細胞，表達大量HA1蛋白;并進一步純化。

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