李燕 遲瑩 卞倩 溫恬 張文帥 焦永軍

流行性感冒(流感)是一種最常見的病毒性急性呼吸道傳染病，至今無法完全加以控制［1－2］，流感給個(gè)人和社會(huì)帶來的經(jīng)濟(jì)損失始終列于各傳染病之首。流感傳染性強(qiáng)，尤其在老年人中有很高的發(fā)病率，并易導(dǎo)致肺炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至死亡［3－4］。其病原為流行性感冒病毒(流感病毒)，屬于正粘病毒科，分甲、乙、丙3個(gè)型別，其中甲型流感病毒的致病力最強(qiáng)［5－6］。近年來，由于甲型流感多次引起大規(guī)模的世界性流行，已引起了研究者們的高度關(guān)注［7－9］。2009年3月起美國、墨西哥出現(xiàn)A/H1NI流感(我國稱甲型H1N1流感)病例并形成疫情，以后迅速蔓延，疫情擴(kuò)大到100多個(gè)國家或地區(qū)，呈全球蔓延態(tài)勢［10－11］。

流感病毒表面血凝素(hemagglutinin，HA)是流感病毒合成的重要蛋白［12］。HA在流感病毒的致病過程中有重要作用，同時(shí) HA和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的差異是甲型流感病毒(influenza virus A)亞型劃分的主要依據(jù)［13］。在動(dòng)物體內(nèi)由于免疫力的作用，流感病毒HA基因非常容易發(fā)生抗原漂移，導(dǎo)致待測病毒與標(biāo)準(zhǔn)檢測抗體的交叉反應(yīng)性差，給檢測及防治工作帶來許多困難。因此，人工表達(dá)HA蛋白，對流感的快速準(zhǔn)確檢測以及制備基因工程疫苗具有重要的應(yīng)用價(jià)值。而HA1是HA基因的高度保守區(qū)域［14－15］，HA 蛋白具有6 個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中5個(gè)N糖基化位點(diǎn)位于HA1上，HA1上的一些區(qū)域表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗原特性，HA1蛋白的表達(dá)與純化對流感的快速準(zhǔn)確檢測以及制備基因工程疫苗具有重要意義，因此，本研究旨在為進(jìn)一步制備快速診斷試劑及開發(fā)基因工程疫苗，構(gòu)建了甲型SWH1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的桿狀病毒真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染sf 9細(xì)胞表達(dá)并純化其編碼蛋白。

1 材料和方法

1.1 病毒毒株、質(zhì)粒及細(xì)胞 江蘇甲型SWH1N1流感病毒毒株［A/Jiangsu/1/2009(H1N1)］、DH10Bac、大腸桿菌E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞及sf 9細(xì)胞為江蘇省疾病預(yù)防控制中心病原生物所保存。

1.2 試劑 PCR試劑盒(Qiagen公司)、膠回收試劑盒(Omega公司);Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Xhol 1 及 Bgl 2、DNA 連接酶試劑盒、pMD18－T Simple Vector試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、RNA提取試劑盒(TaKaRa 公司);Lipofectamine2000、Opti－MEM(Invitrogen 公司);DMEM－1000(Gibco 公司);anti－His antibody(abcam公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 流感病毒總RNA的提取 參照試劑盒使用說明提取流感病毒總RNA。

1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)甲型SWH1N1流感病毒HA1基因序列［A/Jiangsu/1/2009(H1N1)］，設(shè)計(jì)上下游引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如 下:上 游 引 物 5'－GG GAATTCCTATGAAGGCAATACTAGTA－3';下 游 引 物 5'－AG CTCGAGGC TAGGCCTCTAGATTGAAT－3'。引物序列下劃線為酶切位點(diǎn)，分別是 EcoR1(GGATCC)和 Xhol 1(CTCGAG)。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為HA1基因，片段長度約為1038 bp。

1.5 RT－PCR擴(kuò)增甲型SWH1N1流感病毒HA1基因以提取的流感病毒總RNA為模板，一步法擴(kuò)增HA1全長基因，RT－PCR體系參照試劑盒使用說明。RTPCR反應(yīng)條件為:50℃ 30 min，95℃變性15 min，然后94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 真核表達(dá)體系 HA1－p－fast質(zhì)粒的構(gòu)建 EcoR1和Xhol1分別雙酶切陽性HA1 PCR產(chǎn)物與p－fast質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后連接酶切產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10F'感受態(tài)細(xì)胞，涂板后挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行 PCR及酶切鑒定，鑒定為陽性的重組載體進(jìn)行基因測序分析，測序正確的質(zhì)粒命名為 HA1－p－fast。

1.7 轉(zhuǎn)座構(gòu)建桿狀病毒HA1－Bacmid 取測序正確的HA1－p－fast質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH10Bac 細(xì)胞，涂板(平板含:50 μg/ml kana、7 μg/ml的 genta、10 μg/ml tet、100 μg/ml Bluo－gal、40 μg/ml IPTG)，倒置培養(yǎng) 48 h，挑取白斑培養(yǎng)擴(kuò)增(含:50 μg/ml kana、7 μg/ml的 genta、10 μg/ml tet)，菌液經(jīng)M13和HA1雙重PCR鑒定，提取陽性質(zhì)粒，命名為 HA1－Bacmid。

1.8 重組表達(dá)HA1蛋白 sf9細(xì)胞常規(guī)接種于6孔板中，使用含10%胎牛血清的Grace's完全昆蟲培養(yǎng)基，27℃，無CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Bacmid DNA用的Grace's昆蟲培養(yǎng)基(無添加劑、無血清)稀釋混勻后置室溫作用5 min，在另一管中將脂質(zhì)體LipofectamineTM2000與Grace's培養(yǎng)基稀釋混勻室溫作用5 min，將稀釋的質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體培養(yǎng)液混勻，室溫孵育30 min。將混合物加入到培養(yǎng)板中。培養(yǎng)4～6 h，換成Grace's完全昆蟲培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5 d左右，觀察細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞70%以上出現(xiàn)病變后檢測HA1蛋白的表達(dá)。收取HA1蛋白表達(dá)陽性的P1代細(xì)胞上清，依次感染P2、P3代細(xì)胞，以獲得大量的HA1蛋白。

1.9 重組HA1蛋白的純化 收集細(xì)胞，4℃ 7000～8000 g離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，冰水中超聲破碎細(xì)胞，破碎液4℃ 12 000 g離心10 min，加20 mmol/L咪唑溶液，過0.45 μm的濾膜，取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10 ml平衡緩沖液(pH 7.4的50 mmol/L磷酸緩沖液，含 0.5 mol/L NaCl，8 mol/L 脲素，20 mmol/L咪唑)平衡，上樣，洗滌，用5 ml洗脫緩沖液洗(pH 7.4的50 mmol/L磷酸緩沖液含0.5 mol/L NaCl，8 mol/L脲素，含500 mmol/L咪唑)洗脫吸附的樣品，流速1～2 ml/min，2 ml/管收集。

1.10 免疫印跡鑒定表達(dá) 純化蛋白SDS－PAGE蛋白電泳后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉。一抗為1∶500過氧化物酶標(biāo)記的抗HIS多克隆抗體，4℃孵育過夜。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光蛋白免疫印跡法(ECL)進(jìn)行Western blot顯色分析。

2 結(jié)果

2.1 HA1基因的鑒定 HA1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1000 bp處可見單一特異性條帶，大小與HA1基因理論值一致，見圖1。

圖1 HA1基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析

2.2 HA1－p－fast質(zhì)粒的鑒定 通過T4連接酶將EcoR1和Xhol1雙酶切的陽性HA1 PCR產(chǎn)物與p－fast載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑5個(gè)單克隆進(jìn)行特異性HA1引物PCR鑒定，結(jié)果均為陽性(圖2)。取其中1個(gè)陽性克隆搖菌提取質(zhì)粒，EcoR1和Xhol1雙酶切，同時(shí)用HA1引物PCR鑒定，電泳鑒定雙酶切及PCR均有約1000 bp左右的目的帶(圖3)，結(jié)果表明HA1基因片段正確克隆到載體p－fast上。

2.3 HA1－Bacmid的鑒定 取測序正確的 HA1－p－fast質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac細(xì)胞，涂板，培養(yǎng)后挑取5個(gè)陽性克隆，搖菌，菌液經(jīng)HA1的特異性引物和M13的通用引物PCR鑒定，電泳鑒定雙酶切及PCR均有約1000 bp左右的目的條帶(圖4)。結(jié)果表明已獲得正確的HA1－Bacmid。

圖4 HA1－Bacmid瓊脂糖電泳分析

2.4 Western blot鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果 轉(zhuǎn)染HA1－Bacmid的P1代sf9細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白可以被抗His抗體所特異性識別，其大小與預(yù)期相同，同時(shí)空載體組與空白對照組無條帶，表明HA1在sf 9細(xì)胞中得到表達(dá)(圖5)。

圖5 Western印跡法檢測HA1－Bacmid在sf9細(xì)胞的表達(dá)

2.5 重組蛋白的純化鑒定 采用親和層析方法，特異性結(jié)合分離HA1蛋白，收集純化后的蛋白，SDS凝膠電泳，考染后掃描分析目的蛋白的純度為90%左右(圖6)。

圖6 SDS凝膠電泳法檢測HA1蛋白的純化

3 討論

流感病毒的危害性極大，全世界平均每年有50萬～100萬人死于流感［16］。流感傳染性強(qiáng)，尤其在≥60歲的老年人中有很高的發(fā)病率，并易導(dǎo)致肺炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至死亡。流感病毒是致流感的主要病原體。流感病毒屬正粘病毒科，基因組為分節(jié)段負(fù)鏈RNA。甲型流感病毒根據(jù)HA和NA抗原性的不同，HA可以分為16個(gè)亞型，NA分為9個(gè)亞型［17］。H1N1亞型流感病毒和其他甲型流感病毒一樣，其HA基因中的HA1基因變異決定了其抗原性特點(diǎn)，其變異與流感的流行及流行規(guī)模的大小密切相關(guān)［18］。同時(shí)，HA1是各亞型流感之間HA差異的主要區(qū)域，具有型特異性。用HA1蛋白作為檢測抗原，從理論上講應(yīng)該能夠區(qū)別其他亞型的特點(diǎn)，同時(shí)降低鑒別診斷的假陽性率。

桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是真核表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用廣泛的一類表達(dá)系統(tǒng)，有很多優(yōu)點(diǎn)，具有與大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉(zhuǎn)譯外源蛋白的能力，表達(dá)的蛋白具有良好的生物學(xué)活性，表達(dá)水平高;同時(shí)，作為表達(dá)載體的桿狀病毒，其自身的蛋白在哺乳動(dòng)物體內(nèi)也沒有相應(yīng)的抗體，因此與哺乳動(dòng)物的交叉反應(yīng)?。?9］;此外，利用桿狀病毒昆蟲系統(tǒng)表達(dá)的HA1蛋白具有良好的血凝活性，而原核系統(tǒng)表達(dá)的HA1蛋白則不具有這一特性。

本研究用RT－PCR法獲得甲型H1N1流感病毒血凝素HA1基因序列，然后將其與p－fast質(zhì)粒連接，通過PCR擴(kuò)增、酶切和序列測定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確;取測序正確的 HA1－p－fast質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH10Bac，再次鑒定，獲得正確的HA1－Bacmid;感染桿狀病毒sf9昆蟲細(xì)胞，表達(dá)大量HA1蛋白;并進(jìn)一步純化。

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