呂海濤 王文斌 劉潤田 邊 偉 馬毓梅 張樹斌

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050000)

膽囊癌是一種少見的惡性腫瘤并且預(yù)后極差，術(shù)后5年生存率是5% ～42.3%，除手術(shù)之外缺乏有效的治療手段〔1〕。目前對膽囊癌的惡性生物學(xué)行為仍缺乏充分的認(rèn)識(shí)。文獻(xiàn)報(bào)道，趨化因子CXCL12與其受體CXCR4所構(gòu)成的CXCL12-CXCR4生物學(xué)軸(CXCL12-CXCR4 biological axis)在多種實(shí)體腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，其在膽囊癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制未見報(bào)道。本文利用免疫組化方法，檢測CXCL12與CXCR4蛋白在膽囊癌中的表達(dá)，并對其表達(dá)意義進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 材料 我院手術(shù)切除病理證實(shí)膽囊癌標(biāo)本44例、10例膽囊腺瘤。44例膽囊癌患者中，男22例，女22例，年齡40～78〔平均(60.7±16.5)〕歲。術(shù)前均未作放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療。Nevin分期為Ⅰ期3例，Ⅱ期11例，Ⅲ期2例，Ⅳ期7例，Ⅴ期21例;高分化16例，中分化10例，低分化18例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例;腺癌34例，其他10例。

1.2 試劑 兔抗人CXCL12單克隆抗體為美國RD公司產(chǎn)品，鼠抗人CXCR4單克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品。檢測試劑采用福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司免疫組織化學(xué)ElivisionTMplus檢測試劑盒，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 方法 切片常規(guī)脫蠟、水化后，在pH6.0枸櫞酸酸鹽緩沖液中加熱修復(fù)15 min，溫度98℃。0.3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min。滴加一抗(CXCL12稀釋濃度為4μg/ml;CXCR4稀釋濃度為5μg/ml工作液)，孵育過夜，滴加聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20 min。滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30 min，滴加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化。用已知陽性切片作對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 CXCL12和CXCR4陽性細(xì)胞均為胞膜和胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色顆粒，從陽性腫瘤細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色深淺兩個(gè)方面評(píng)分〔2〕。染色強(qiáng)度通過觀察腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞相比較，定為:無著色，0分;淺著色，1分;中等著色，2分;強(qiáng)著色，3分。根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞占總的觀察細(xì)胞的 ＜10%、10% ～49%、50% ～74%、≥75%分別定為0、1、2、3分，兩項(xiàng)最后相加，0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料分析應(yīng)用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 CXCL12與CXCR4在膽囊癌及膽囊腺瘤中的表達(dá)及其與病理指標(biāo)的關(guān)系 CXCL12陽性染色定位膽囊癌細(xì)胞胞質(zhì)，呈淺黃色到棕黃色顆粒狀。44例膽囊癌組織中31例CXCL12表達(dá)陽性〔70.1%(31/44)〕，而10例膽囊腺瘤組織陽性率為60%，腫瘤組織中CXCL12表達(dá)陽性率與膽囊腺瘤組織無顯著差異(P＞0.05)。CXCL12蛋白的表達(dá)與膽囊癌的Nevin分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。見表1，圖1。

CXCR4的蛋白質(zhì)表達(dá)主要定位于膽囊癌細(xì)胞胞質(zhì)，免疫組化染色呈棕黃色。44例膽囊癌組織中28例CXCR4表達(dá)陽性〔61.1%(27/44)〕，而10例膽囊腺瘤組織陽性率為20%，腫瘤組織中CXCR4表達(dá)陽性率與膽囊腺瘤組織有顯著差異(P＜0.05)。CXCR4蛋白的表達(dá)與膽囊癌的Nevin分期有關(guān)(P＜0.05)。見表1，圖2。

2.2 膽囊癌組織中CXCL12與CXCR4蛋白表達(dá)的相關(guān)性CXCL12與CXCR4表達(dá)之間的Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.207，P＞0.05，提示CXCL12與CXCR4的表達(dá)無相關(guān)關(guān)系。

表1 膽囊癌中CXCL12與CXCR4表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系

圖1 膽囊癌細(xì)胞CXCL12陽性表達(dá)(×400，IHC SP法)

圖2 膽囊癌細(xì)胞CXCR4陽性表達(dá)(×400，IHC SP法)

3 討論

過去對CXCL12-CXCR4的研究主要集中于免疫學(xué)，尤其是在艾滋病病毒(HIV)感染T淋巴細(xì)胞機(jī)制以及抗HIV藥物的研制。近年來，人們開始研究CXCL12-CXCR4在腫瘤組織中的表達(dá)情況。CXCL12與CXCR4所構(gòu)成的耦聯(lián)分子對介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞與細(xì)胞遷移密切相關(guān)，故稱為CXCL12-CXCR4生物學(xué)軸，兩者的相互作用可以影響腫瘤細(xì)胞的定向遷移、增殖等活動(dòng)，在多種腫瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌、口腔鱗癌等的浸潤發(fā)展中發(fā)揮著重要作用〔3〕。

有報(bào)道CXCL12在卵巢癌、胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達(dá)〔4〕。在易發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織如肺、肝臟、骨骼中亦有表達(dá)〔5〕。本文檢測了CXCL12在膽囊癌以及膽囊腺瘤中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CXCL12在膽囊癌以及膽囊腺瘤中均有表達(dá)，但兩者差異無顯著性。CXCL12蛋白的表達(dá)與膽囊癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，臨床分期越晚和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中CXCL12表達(dá)越高，說明CXCL12可能參與了膽囊癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程。

CXCR4(即CD184)是人類腫瘤中最常見的趨化因子受體。多達(dá)23種以上的上皮性、間葉性和血液源性腫瘤細(xì)胞表達(dá)CXCR4，發(fā)揮著重要的病理和生理作用。雖然CXCR4表達(dá)于各種組織，但在許多正常組織(乳腺、卵巢)〔6〕中不表達(dá)或低表達(dá)。CXCR4在腫瘤組織中的表達(dá)差異導(dǎo)致個(gè)體腫瘤的不同發(fā)展方向。Balkwill〔7〕等研究認(rèn)為原發(fā)腫瘤灶CXCR4表達(dá)陽性腫瘤細(xì)胞較陰性者具有更高的轉(zhuǎn)移潛能，前者可趨向性運(yùn)動(dòng)到其他淋巴結(jié)及器官，形成特異性轉(zhuǎn)移灶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CXCR4可能在膽囊腺瘤向膽囊癌惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮一定作用。CXCR4蛋白的表達(dá)與膽囊癌的臨床分期有關(guān)，臨床分期越晚的腫瘤中CXCR4表達(dá)越高，說明表達(dá)CXCR4的膽囊癌細(xì)胞可能向表達(dá)CXCL12的肝臟定向遷移，參與了膽囊癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程。

CXCL12-CXCR4在腫瘤組織中發(fā)揮著重要的病理和生理作用〔8〕。CXCL12通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號(hào)途徑，不僅能促進(jìn)表達(dá)CXCR4的癌細(xì)胞順濃度梯度遷移，并且能通過自分泌和旁分泌的方式促進(jìn)癌細(xì)胞生長〔6〕。推測在膽囊癌中CXCL12與CXCR4之間可能并無直接相互調(diào)節(jié)作用，Schioppa〔9〕研究認(rèn)為是缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-кB)以及腫瘤抑制蛋白(VHL)上調(diào)CXCL12及CXCR4的水平。

1 Kohya N，Kitahara K，Miyazaki K.Rational therapeutic strategy for T2 gallbladder carcinoma based on tumor spread〔J〕.World JGastroenterol，2010;16(28):3567-72.

2 魏 梅，梁立治，張昌卿，等.宮頸腺癌細(xì)胞CXCR4/CXCL12過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和慢性炎癥的關(guān)系〔J〕.癌癥，2007;26(3):298-302.

3 Muller A，Homev B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis〔J〕.Nature，2001;410(6824):50-6.

4 Koshiba T，Hosotani R，MivamotoY，et al.Expression of stromal cell-derived factor 1 and CXCR4 ligand receptor system in pancreatic cancer:a possible role for tumor progression〔J〕.Clin Cancer Res，2000;6(9):3530-5.

5 Salcedo R，Wasserman K，Young HA，et al.Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor induce expression of CXCR4 on human endothelial cells:in vivo neovascularization induced by stromalderived factor-1α〔J〕.Am JPathol，1999;154(4):1125-35.

6 Scotton CJ，Wilson JL，Scott K，et al.Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer〔J〕.Cancer Res，2002;62(20):5930-8.

7 Balkwill F.Cancer and the chemokine network〔J〕.Nat Rev Cancer，2004;4(7):540-50.

8 Katayama A，Ogino T，Bandoh N，et al.Expression of CXCR4 and its down-regulation by IFN-gamma in head and neck squamous cell carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(8):2937-46.

9 Schioppa T，Uranchimeg B，Saccani A，et al.Regulation of the chemokine receptor CXCR4 by hypoxia〔J〕.J Exp Med，2003;198(9):1391-402.