靳 淇 陳海燕 王 威 孔 儉

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院干部病房，吉林 長春 130021)

目前，世界范圍內(nèi)降壓治療的趨勢是在降壓同時改善代謝紊亂，預(yù)防靶器官損害或逆轉(zhuǎn)靶器官的重塑。自從胰島素抵抗與高血壓之間的關(guān)系被揭示，通過應(yīng)用胰島素增敏劑改善胰島素抵抗的降壓治療，以達(dá)到降低高血壓的發(fā)病率和病死率的策略和治療方向正逐漸被人接受。本文利用吡格列酮配合生活方式干預(yù)作為糾正胰島素抵抗的綜合措施，重點觀察采取綜合措施糾正胰島素抵抗對自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠心肌的保護(hù)作用，探討改善胰島素抵抗與高血壓之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物 SHR大鼠33只，雄性，購自北京維通利華公司，鼠齡6～7 w，體重120～160 g，分為4～6只/籠飼養(yǎng)，室溫20℃ ～24℃，控制晝夜光照，避免過多噪聲及其他干擾。觀察期為1 w，實驗期為12 w。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方法 全部大鼠隨機(jī)分為3組，觀察飼養(yǎng)1 w使大鼠適應(yīng)環(huán)境。①SHR空白組(SHR組，n=11)，予鼠糧及清水。②吡格列酮配合生活方式干預(yù)組(P組，n=11)，予鹽酸吡格列酮45 mg/L，加入飲水中灌胃。批號:H20050200，廠家:日本武田藥品工業(yè)株式會社，同時給予生活方式干預(yù)。③硝苯地平組(N組，n=11)，硝苯地平加入飲水中，140 mg/L灌胃。

1.2.2 生活方式干預(yù)方法 ①飲食控制方法:每周測量1次SHR組大鼠24 h進(jìn)食量，計算平均進(jìn)食量，P組每日清晨給予SHR組平均鼠糧的90%;②游泳方法及條件:P組每日觀察游泳6～15 min，同一時間在安靜條件下進(jìn)行，以大鼠漂浮水面不動并出現(xiàn)頭部下沉為停止信號，水溫28℃ ～30℃，水深50 cm，保證大鼠不能觸及底部及側(cè)壁逃避運動。SHR組及N組大鼠僅放置于鼠籠中自由生活及進(jìn)食。

1.2.3 血液采集方法 在實驗第12周結(jié)束時，大鼠禁食8 h后，乙醚麻醉，仰位固定于手術(shù)臺上，腹主動脈取血，血液標(biāo)本10 min內(nèi)以4 000 r/min速度離心5 min后2 h內(nèi)送檢，比色法測量血清中eNOS水平(eNOS試劑盒購于南京建成生物工程研究所)。

1.2.4 組織取材 將麻醉大鼠沿正中線剪開腹腔，開胸迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗殘血后濾紙吸干。取左室游離壁心肌約0.3 cm×0.3 cm，置于10%中性甲醛溶液中固定。

1.2.5 光鏡標(biāo)本制作 大鼠左室游離壁心肌經(jīng)乙醇充分脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5μm厚的切片保存，蘇木素-伊紅(HE)染色，在200倍光鏡(Olympus PM-10AO)下觀察心肌病變的組織學(xué)形態(tài)。

1.2.6 免疫組化方法檢測大鼠心肌eNOS蛋白表達(dá) 采用抗生物素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(ABC)，按說明書操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，兔抗大鼠eNOS抗體購于武漢博士德生物工程公司，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，且其著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽性。應(yīng)用 LX70OLYMPUS顯微鏡Cooled CCD采集視野圖片，采用計量分析系統(tǒng)(Image-Pro-Plus Analysis Software)進(jìn)行分析，計算各組大鼠心肌陽性信號的平均密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以x±s表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實驗前期，各組大鼠飲食及活動正常。實驗開始后，SHR組及N組大鼠不限制鼠糧及飲水，P組每日清晨給予SHR組前1 w每日平均進(jìn)食量的90%。P組大鼠第1周游泳時間為6～8 min，第12周時可堅持到15 min，呈現(xiàn)逐漸延長趨勢。整個實驗期大鼠無意外死亡。

2.2 大鼠血清eNOS水平 P組大鼠血清中eNOS含量〔(20.2±3.9)U/ml〕最高，與 SHR 組〔(16.7 ±4.2)U/ml〕相比差異有顯著性意義(P＜0.05)，SHR組與N組大鼠血清中eNOS含量〔(16.0±2.6)U/ml〕相比差異無顯著性意義。

2.3 大鼠心肌光鏡觀察結(jié)果 SHR組:心肌間質(zhì)擴(kuò)大、水腫，心肌內(nèi)層可見點狀或微小心肌壞死，局部伴少量單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，心內(nèi)膜和心外膜未見異常。N組:心肌間質(zhì)輕度增大、水腫，心肌內(nèi)層、心壁內(nèi)可見點狀心肌壞死，局部伴少量單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，心內(nèi)膜和心外膜未見異常。P組:心肌間質(zhì)增大、水腫較SHR組減輕，心肌內(nèi)層可見點狀或微小心肌壞死，壞死灶較SHR組及N組減輕，局部無明顯單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，心內(nèi)膜和心外膜未見異常。見圖1。

2.4 免疫組化結(jié)果 各組大鼠心肌細(xì)胞質(zhì)中均可見eNOS陽性信號表達(dá)，其中SHR組著色強(qiáng)度較淺，呈淡黃褐色，P組著色強(qiáng)度最深，呈棕黃色。通過灰度掃描計算，N組著色強(qiáng)度〔(16.5±2.8)%〕略高于SHR組〔(14.3±2.4)%〕，與SHR組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);P組〔(38.4±4.2)%〕大鼠心肌eNOS表達(dá)高于SHR組及N組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見圖2。

圖1 心肌光鏡觀察結(jié)果(HE，×200)

圖2 心肌eNOS免疫組化結(jié)果(DAB，×200)

3 討論

近年來認(rèn)為高血壓是代謝綜合征(MS)的重要組成部分，與胰島素抵抗有直接關(guān)系。許多研究表明高血壓人群約60%伴有胰島素抵抗，同時提示高胰島素血癥是導(dǎo)致高血壓的重要原因〔1，2〕。筆者先前的研究工作發(fā)現(xiàn)吡格列酮配合生活方式干預(yù)有很好的降低SHR大鼠血壓的作用，可能是通過減輕胰島素抵抗、增加胰島素敏感性來發(fā)揮降壓機(jī)制，同時這種治療組合方法可較好的調(diào)整糖脂代謝，血管壁保護(hù)作用強(qiáng)，可減輕動脈硬化發(fā)生的危險因素〔3～5〕。胰島素增敏劑配合生活方式干預(yù)的綜合治療措施可作為糾正胰島素抵抗的方法應(yīng)用到存在胰島素抵抗的原發(fā)性高血壓的治療當(dāng)中。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是人體最大的內(nèi)分泌、旁分泌器官，能分泌幾十種血管活性物質(zhì)，NO就是其中之一。血管內(nèi)皮也是高血壓形成和發(fā)展過程中重要的靶組織，與高血壓有密切的關(guān)系。高血壓可以導(dǎo)致并加重血管內(nèi)皮功能障礙，而血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損反過來又能加劇血壓的增高〔6，7〕。NO信號系統(tǒng)的健全又是內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮生理作用的關(guān)鍵，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO是由eNOS經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成的，NO是調(diào)節(jié)血管基礎(chǔ)張力和血壓的重要因子，是迄今所知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管舒張因子。體內(nèi)eNOS受遺傳和環(huán)境因素的調(diào)節(jié)，其活性需多種因素的參與和調(diào)控，在多種心血管疾病中發(fā)現(xiàn)eNOS基因表達(dá)發(fā)生改變〔8〕，已有學(xué)者將eNOS作為心血管疾病基因治療的首選酶〔9〕。研究證明eNOS活性降低，NO生成減少是血壓升高的重要原因〔10～12〕。本研究顯示，P組大鼠血清中eNOS含量最高，提示吡格列酮配合生活方式干預(yù)可以通過升高血液中eNOS含量，恢復(fù)eNOS生物學(xué)功能并減輕氧化應(yīng)激，發(fā)揮降壓及心血管系統(tǒng)保護(hù)作用。

光鏡下心肌形態(tài)學(xué)觀察顯示各組大鼠心肌HE染色心內(nèi)膜和心外膜未見明顯異常，心肌間質(zhì)均有不同程度的增大、水腫，心肌內(nèi)層可見小灶狀心肌壞死，單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤程度也不同。心肌形態(tài)學(xué)病理改變以SHR組及N組程度最重，P組病理改變最輕，而且無明顯單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，可見高血壓可導(dǎo)致左室向心性肥厚。SHR大鼠心肌間質(zhì)水腫，輕度壞死并出現(xiàn)代償性損傷的改變，是左室心功能受損的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。吡格列酮配合生活方式干預(yù)可明顯抑制高血壓引起的心肌間質(zhì)增大及水腫，減輕心肌內(nèi)層的微小心肌壞死及單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，發(fā)揮了良好的心臟保護(hù)作用，并且效果明顯好于硝苯地平。

硝苯地平是一種短效鈣離子拮抗劑，為二氫吡啶類化合物，在本實驗中置于大鼠飲水中供24 h飲用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝苯地平對心肌也有一定的保護(hù)作用，支持國外的研究結(jié)果〔13〕。鈣拮抗劑對高血壓心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用主要是通過減輕細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載，抑制心肌纖維的過度收縮，減少能量消耗和溶酶體酶系的活性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)硝苯地平也還具有增加NO活性、減輕自由基損傷、保護(hù)血管內(nèi)皮功能等方面的作用，從而對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生較好的保護(hù)作用〔14〕，有關(guān)研究結(jié)果鞏固了鈣拮抗劑類降壓藥物的核心地位。

心肌eNOS免疫組化結(jié)果顯示，各組大鼠心肌細(xì)胞質(zhì)中可見eNOS陽性信號表達(dá)，強(qiáng)度有所不同，以SHR組及N組最弱，P組最強(qiáng)。通過灰度掃描計算，P組心肌eNOS表達(dá)均明顯高于SHR組及N組?？梢钥闯?，高血壓時，心肌eNOS可有一定程度的表達(dá)，提示在損傷因素存在時，機(jī)體有一定的保護(hù)能力，eNOS呈代償性增高，但增高的程度有限，不足以對抗損傷因素，導(dǎo)致靶器官持續(xù)受損。硝苯地平治療后可以提高心肌eNOS表達(dá)，但與SHR組相比無明顯差異。分析原因可能為硝苯地平是短效鈣拮抗劑，實驗發(fā)現(xiàn)其降壓迅速有效，開始時即能對SHR大鼠血壓增長有良好的控制，但缺乏持久性，實驗后期其治療組血壓有回升趨勢，eNOS保護(hù)作用下降，心肌呈低表達(dá)狀態(tài)。應(yīng)用吡格列酮配合生活方式干預(yù)治療的SHR大鼠，心肌eNOS免疫組化呈強(qiáng)陽性表達(dá)，提示胰島素增敏劑配合生活方式干預(yù)具有很好的心肌保護(hù)作用。這種綜合干預(yù)措施顯著地對高血壓所致的心臟結(jié)構(gòu)和功能均有較好的保護(hù)作用，避免或減輕SHR大鼠的靶器官受損。

降壓藥物的心血管系統(tǒng)保護(hù)作用至關(guān)重要，只有具備這種保護(hù)作用的降壓藥物才有臨床應(yīng)用價值及進(jìn)一步研究的前景，才有可能被廣泛應(yīng)用來降低高血壓患者心血管并發(fā)癥的發(fā)病率。近些年來國內(nèi)外開始關(guān)注噻唑烷二酮類藥物(TZDs)降壓作用和心血管系統(tǒng)保護(hù)作用的研究，國內(nèi)外有關(guān)TZDs心血管系統(tǒng)保護(hù)作用機(jī)制的研究顯示〔15～17〕，TZDs作為人工合成的過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)的激動劑，可以明顯緩解胰島素抵抗和平抑高胰島素血癥，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，避免氧化損傷，抑制Ca2+通道活性，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)與功能，減輕平滑肌細(xì)胞的增殖以及膠原組織在血管壁的堆集。這些研究結(jié)果均可揭示胰島素抵抗在高血壓心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的形成和發(fā)展過程中的重要病理基礎(chǔ)，因此應(yīng)用有糾正胰島素抵抗作用的藥物進(jìn)行對高血壓靶器官保護(hù)作用的研究，對高血壓發(fā)病機(jī)制的完善也有著深遠(yuǎn)的意義。本實驗從形態(tài)學(xué)上及免疫組織化學(xué)的角度發(fā)現(xiàn)應(yīng)用吡格列酮配合生活方式干預(yù)的搭配方法在取得良好降壓效果的同時還具有心肌保護(hù)作用，這種抑制靶器官受損的作用是今后對TZDs研究的重點。

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