鐘明奎

(安徽醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

下丘腦室旁核 (PVN)與神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其下行纖維可投射到脊髓中間外側(cè)柱交感節(jié)前神經(jīng)元和延髓腹外側(cè)頭端 (RVLM)〔1〕。PVN存在多種神經(jīng)遞質(zhì)及其相應(yīng)受體，其中血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)及其AT1受體在該區(qū)含量豐富。PVN內(nèi)AngⅡ可通過AT1受體引起血壓升高和交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，在心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。RVLM是心血管功能調(diào)節(jié)的中心區(qū)域，有發(fā)放緊張性沖動(dòng)的心血管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，腦內(nèi)升壓、降壓調(diào)節(jié)區(qū)主要通過它投射到脊髓中間外側(cè)柱，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)心血管活動(dòng)調(diào)節(jié)的最后通路。研究表明PVN-RVLM通路在交感神經(jīng)系統(tǒng)和心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)中起著重要作用〔2〕。對(duì)PVN神經(jīng)元的化學(xué)刺激可使RVLM中的網(wǎng)狀脊髓束血管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮，使血壓升高。然而，PVN內(nèi)AngⅡ引起的升壓作用是否涉及PVN-RVLM傳出通路及其機(jī)制還不清楚。本研究探討RVLM內(nèi)活性氧 (ROS)在介導(dǎo)PVN內(nèi)AngⅡ引起的交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性成年SD大鼠，體重300～400 g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器和藥品 PowerLab/8SP數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)、橋式放大器 (ADInstruments，澳大利亞)，交流/直流差分放大器(A-M System Inc.，美國(guó))，腦立體定位儀、微量注射泵(Stoelting Co.，美國(guó))，小動(dòng)物呼吸機(jī) (Harvard Apparatus Inc.，美國(guó))。AngⅡ、超氧陰離子清除劑4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶 (Tempol)、內(nèi)源性超氧化物歧化酶擬似物聚乙二醇-超氧化物歧化酶 (polyethylene glycol-superoxide dismutase，PEG-SOD)用生理鹽水配制，NAD(P)H氧化酶抑制劑夾竹桃麻素 (Apocynin)或氧化酚砷 (phenylarsine oxide，PAO)用1%二甲基亞砜 (DMSO)配制，上述藥品均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 動(dòng)物手術(shù) 腹腔注射氨基甲酸乙酯 (800 mg/kg)和氯醛糖 (40 mg/kg)混合麻醉，每小時(shí)靜脈注射初始麻醉劑量的1/10維持麻醉。頸部正中切口，氣管插管與呼吸機(jī)相連行正壓呼吸，右側(cè)頸外靜脈插管用于靜脈給藥。暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈竇區(qū)，分離并切斷所有支配頸動(dòng)脈竇的神經(jīng)纖維，切斷雙側(cè)迷走神經(jīng)，剝離頸總動(dòng)脈分叉處上下各4 mm范圍內(nèi)動(dòng)脈周圍結(jié)締組織，并涂以10%苯酚溶液以破壞該區(qū)域殘余的神經(jīng)纖維。確認(rèn)壓力感受器去神經(jīng)支配成功的標(biāo)準(zhǔn):靜脈注射苯腎上腺素 (20μg/kg)后平均動(dòng)脈壓 (MAP)增加25 mmHg以上時(shí)心率 (HR)變化不超過5次/min，則壓力感受器去神經(jīng)支配成功。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)和腎交感神經(jīng)活動(dòng)記錄 用充有肝素生理鹽水溶液的PE-50聚乙烯管插入右側(cè)頸總動(dòng)脈，經(jīng)壓力傳感器與四通橋式放大器相連，經(jīng)PowerLab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)記錄動(dòng)脈血壓，并對(duì)血壓信號(hào)進(jìn)行處理，同步記錄動(dòng)脈血壓、MAP和HR。經(jīng)腰部縱行切口沿腹膜后路徑暴露腎臟，游離腎交感神經(jīng)，并浸入溫石蠟油中，安放銀絲電極引導(dǎo)腎交感神經(jīng)活動(dòng) (RSNA)，經(jīng)交流/直流差分放大器放大后用Power-Lab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)記錄RSNA，并對(duì)RSNA進(jìn)行積分處理，同步記錄原始RSNA和RSNA積分值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)切斷腎神經(jīng)中樞端以消除腎交感神經(jīng)傳出活動(dòng)，記錄噪音水平，RSNA積分值減去噪音積分值即為實(shí)際RSNA積分值。RSNA的值以變化的百分率來表示。

1.5 立體定位和微量注射 將大鼠頭部固定于立體定位儀上，暴露顱骨，根據(jù)Paxinos和Watson的大鼠立體定位圖譜，定位RVLM(人字縫尖后4.5～5.0 mm，中線旁開1.8～2.1 mm，小腦背側(cè)表面下8.1～8.4 mm)和PVN(AP－1.8 mm，RL 0.4 mm，H 7.9 mm)。用針尖外徑為50μm的玻璃微電極向核團(tuán)內(nèi)注射藥液，注射容積50 nl，30 s內(nèi)注射完畢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)核團(tuán)內(nèi)注射50 nl的0.25%伊文思藍(lán)溶液，過量麻醉處死大鼠，取腦，將其放入10%甲醛溶液中固定1 w后，腦組織切片鑒定注射位點(diǎn)。

1.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組 (1)PVN內(nèi)注射AngⅡ?qū)桓猩窠?jīng)活動(dòng)和動(dòng)脈血壓的影響:大鼠隨機(jī)分為4組，每組5只，分別在PVN內(nèi)注射生理鹽水、3種劑量的AngⅡ (0.03，0.3和3 nmol)，觀察其對(duì)RSNA和MAP的影響。(2)RVLM內(nèi)ROS在介導(dǎo)PVN內(nèi)AngⅡ效應(yīng)中的作用:大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別在RVLM內(nèi)注射生理鹽水、Tempol(20 nmol)和PEG-SOD(2 U)，10 min后PVN內(nèi)注射AngⅡ，觀察其對(duì)RSNA和MAP的影響。(3)RVLM內(nèi)NAD(P)H氧化酶在調(diào)節(jié)PVN內(nèi)AngⅡ效應(yīng)中的作用;大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別在RVLM內(nèi)加DMSO(1%，50 nl)、NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin(1 nmol)和PAO(1 nmol)，10 min后PVN內(nèi)注射Ang II，觀察其對(duì)RSNA和MAP的影響。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS10.0軟件，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，同一只動(dòng)物用藥前后觀察值的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析并采用SNK檢驗(yàn)做樣本間的多重比較。

2 結(jié)果

2.1 PVN內(nèi)注射AngⅡ?qū)SNA和MAP的影響 PVN內(nèi)微量注射AngⅡ (0.03、0.3或3.0 nmol)劑量依賴性地引起RSNA增強(qiáng)和MAP升高，但對(duì)HR無顯著影響。與生理鹽水組相比，大劑量AngⅡ (3.0 nmol)引起 RSNA〔(0.1±2.2)%vs(12.9±1.9)%，P＜0.01〕和MAP 〔(0.4±1.4)mmHg vs(10.0±1.5)mmHg，P＜0.01〕顯著增加。見圖1。

2.2 RVLM內(nèi)ROS在介導(dǎo)PVN內(nèi)AngⅡ效應(yīng)中的作用RVLM內(nèi)微量注射超氧陰離子清除劑Tempol對(duì)RSNA和MAP無顯著影響，但可明顯減弱PVN注射AngⅡ引起的RSNA增強(qiáng) 〔(0.2±2.6)%，vs(10.2±1.9)%，P＜0.01〕和MAP〔(5.2±1.7)mmHg vs(11.0±1.2)mmHg，P＜0.01〕升高效應(yīng)。RVLM內(nèi)微量注射PEG-SOD對(duì)RSNA和MAP也無顯著影響，同樣也可抑制PVN注射AngⅡ引起的效應(yīng)，RSNA:〔0.15±1.6)%，vs(10.2±1.9)%，P＜0.01〕和 MAP〔(4.6±2.0)mmHg vs(11.0±1.2)mmHg，P ＜0.01〕。見圖2。

2.3 RVLM內(nèi)NAD(P)H氧化酶在調(diào)節(jié)PVN內(nèi)AngⅡ效應(yīng)中的作用 RVLM內(nèi)微量注射NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin抑制內(nèi)源性ROS的生成對(duì)RSNA和MAP無顯著影響，但可明顯減弱 PVN注射 AngⅡ引起的 RSNA增強(qiáng)〔(0.2±1.7)%，vs(9.1±2.3)%，P＜0.01〕和 MAP〔(5.0±1.4)mmHg vs(12.3±1.3)mmHg，P＜0.01〕升高效應(yīng)。RVLM內(nèi)微量注射另一種NAD(P)H氧化酶抑制劑PAO，同樣也可抑制 PVN注射 AngⅡ引起的效應(yīng) RSNA〔1.5±2.7)%，vs(9.1±2.3)%，P＜0.01〕和 MAP〔(3.5±1.4)mmHg vs(12.3±1.3)mmHg，P＜0.01〕。見圖3。

圖1 大鼠PVN內(nèi)注射AngⅡ?qū)SNA和MAP的影響(n=5)

圖2 RVLM內(nèi)活性氧在介導(dǎo)PVN內(nèi)效應(yīng)中的作用(n=6)

圖3 RVLM內(nèi)NAD(P)H氧化酶在調(diào)節(jié)PVN內(nèi)AngⅡ效應(yīng)中的作用(n=6)

3 討論

PVN是調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活動(dòng)和動(dòng)脈血壓的重要中樞結(jié)構(gòu)之一〔3〕，PVN內(nèi)AngⅡ可通過AT1受體引起血壓升高和交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，在心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。RVLM有發(fā)放緊張性沖動(dòng)的心血管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，腦內(nèi)升壓、降壓調(diào)節(jié)區(qū)主要通過它投射到脊髓中間外側(cè)柱，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)心血管活動(dòng)調(diào)節(jié)的最后通路。研究表明PVN-RVLM通路在交感神經(jīng)系統(tǒng)和心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)PVN內(nèi)微量注射AngⅡ劑量依賴性地引起RSNA增強(qiáng)和MAP升高。應(yīng)用超氧陰離子清除劑Tempol和內(nèi)源性超氧化物歧化酶擬似物PEG-SOD清除RLVM內(nèi)ROS，或應(yīng)用NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin和PAO抑制RLVM內(nèi)ROS的生成可顯著減弱PVN內(nèi)注射AngⅡ引起的交感興奮效應(yīng)。結(jié)果表明RLVM內(nèi)NAD(P)H氧化酶來源的ROS介導(dǎo)了PVN內(nèi)AngⅡ的交感興奮作用。

Tempol是一種超氧陰離子的清除劑，細(xì)胞膜對(duì)其具有高度的通透性。本研究發(fā)現(xiàn)RVLM微量注射 Tempol幾乎完全消除了PVN微量注射AngⅡ引起的RSNA增強(qiáng)和MAP升高效應(yīng)，提示Tempol可能通過降低RVLM中ROS水平而起作用。Sun等〔4〕發(fā)現(xiàn)AngⅡ增加下丘腦及腦干神經(jīng)元內(nèi)ROS生成，且AngⅡ引起的神經(jīng)元放電活動(dòng)增強(qiáng)與神經(jīng)元內(nèi)ROS水平呈正相關(guān);Lu等〔5〕發(fā)現(xiàn)中樞注射Tempol可以抑制側(cè)腦室注射AngⅡ引起的RSNA增強(qiáng)，均支持本文結(jié)果?？紤]到Tempol可能具有一些與清除ROS無關(guān)的非特異性作用，筆者又研究了內(nèi)源性超氧化物歧化酶擬似物PEG-SOD的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEG-SOD具有與Tempol相似的作用，進(jìn)一步提示RVLM中的ROS在介導(dǎo)PVN中AngⅡ引起的交感興奮中起重要作用。

眾多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明ROS作為信號(hào)分子在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用〔6〕。ROS是氧在生物體內(nèi)通過單電子還原產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)，包括超氧負(fù)離子自由基()、過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(·OH)等。涉及ROS生成的酶主要包括NAD(P)H氧化酶、黃嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶(NOS)〔7〕，其中NAD(P)H氧化酶在心血管、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病以及在正常心血管、神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)控中起了重要作用〔8〕。NAD(P)H氧化酶可被某些激素和組織局部代謝產(chǎn)物等激活，使酶的活性顯著增加〔9〕。眾多研究表明在血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、外膜細(xì)胞和心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞中，AngⅡ是NAD(P)H氧化酶的重要的激活物之一〔10〕，可上調(diào)大部分NAD(P)H氧化酶亞基的基因表達(dá)〔11〕，目前NAD(P)H氧化酶和中樞AngⅡ的關(guān)系成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。Zimmerman等〔12〕用Rac1顯性失活同形物抑制NAD(P)H氧化酶的活性后，AngⅡ所引起的ROS生成也被抑制，同時(shí)也消除了中樞AngⅡ引起的升高血壓和增加飲水行為效應(yīng)。AngⅡ興奮NTS、下丘腦、腦干等中樞自主神經(jīng)元的效應(yīng)伴隨著該部分神經(jīng)元內(nèi)NAD(P)H氧化酶活性及ROS水平的增加〔13〕，提示AngⅡ可激活外周組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)NAD(P)H氧化酶。

Apocynin是一種NAD(P)H氧化酶的抑制劑，它通過干擾NAD(P)H氧化酶的裝配，即干擾p47phox和p67phox與NAD(P)H氧化酶的膜復(fù)合物結(jié)合，從而抑制外周和中樞組織中超氧陰離子的生成〔14〕。PAO是另一種NAD(P)H氧化酶抑制劑，其分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制與Apocynin不同，它不干擾酶的胞漿成分轉(zhuǎn)移及其與膜成分的結(jié)合，而是作用于NAD(P)H氧化酶膜相關(guān)蛋白的鄰位巰基結(jié)構(gòu)，與其形成一個(gè)穩(wěn)定的五環(huán)結(jié)構(gòu)，從而影響超氧陰離子的生成〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)RVLM內(nèi)注射Apocynin或 PAO均可抑制 PVN內(nèi) AngⅡ的作用，提示RLVM內(nèi)NAD(P)H氧化酶來源的ROS介導(dǎo)了PVN內(nèi)AngⅡ的交感興奮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用超氧陰離子清除劑Tempol和內(nèi)源性超氧化物歧化酶擬似物PEG-SOD清除RLVM內(nèi)ROS，或應(yīng)用NAD(P)H氧化酶抑制劑Apocynin和PAO抑制RLVM內(nèi)ROS的生成對(duì)RSNA和MAP沒有顯著影響，表明在正常生理狀況下RLVM內(nèi)源性ROS不參與心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)。

綜上，本研究表明RVLM中的ROS介導(dǎo)PVN中AngⅡ 引起的交感興奮增強(qiáng)，NAD(P)H氧化酶是該過程中ROS生成的重要起源。

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