章谷成,袁海娜,肖功年

花色苷(Anthocyanin)是一類水溶性色素,由花色苷配基(即花色素)和糖基以糖苷鍵結(jié)合形成。其中花色素是類黃酮化合物[1-3],屬于多酚類物質(zhì)。食品中常見(jiàn)的花色苷主要有:花翠素(飛燕草色素)、花青素(矢車菊素)、3′-甲花翠素(牽?；ㄉ?、甲基花青素(芍藥色素)、二甲花翠素(錦葵色素)、天竺葵色素等種類[4-9]。據(jù)報(bào)道,花色苷具有降低肝臟及血清中脂肪含量、抗氧化、抗腫瘤、延緩血小板凝集等保健和藥理作用[10],在食品、化妝品、醫(yī)藥領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。

葡萄花色苷是一種天然食用色素,主要分布于葡萄的果皮、果肉、葡萄籽、芽鱗片等部位,果皮含量最高[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助萃取技術(shù)制備了紫葡萄皮花色苷(anthocyanin from purple grape skin,APGS),研究了APGS的色澤變化、光譜學(xué)性質(zhì)和定量測(cè)定方法,并采用紙層析和薄層層析方法對(duì)APGS進(jìn)行了初步組分檢測(cè),為APGS的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了重要的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

UV-2102PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司),CF15R HITACH冷凍離心機(jī)(天肯(上海)貿(mào)易有限公司),DHG-9023型全自動(dòng)電腦干燥箱(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠),RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(上海亞容生化儀器廠),KQ3200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),AB 204-N電子天平(上海世義精密儀器有限公司)。

1.1.2 材料與試劑

原料:新鮮杭州產(chǎn)“巨峰”紫葡萄,購(gòu)于杭州市留下菜市場(chǎng),去除果肉,取葡萄皮。

主要試劑:無(wú)水乙醇、濃鹽酸、醋酸、甲醇、蒸餾水、正丁醇、冰醋酸、鹽酸、異丁醇、無(wú)水乙酸鈉等,以上均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 APGS的制備

選取新鮮紫皮葡萄,去除果肉,準(zhǔn)確稱取鮮葡萄皮100 g,以預(yù)冷的70%乙醇勻漿,按固液比1∶7加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇,并以1%鹽酸調(diào)節(jié)料液pH值為3.5,采用超聲波浸提30 min(超聲波頻率40 k Hz,功率150 W),浸提液于4℃離心,取上清液于(35±3)℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),得APGS浸膏,冷藏備用。

1.2.2 APGS吸收光譜及最大吸收波長(zhǎng)的確定

取一定量的APGS浸膏,經(jīng)適當(dāng)稀釋,以70%乙醇為空白,檢測(cè)其200～700 nm波長(zhǎng)下的吸收?qǐng)D譜,并確定APGS在可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng),記λmax。

1.2.3 APGS定量測(cè)定方法

采用p H示差法測(cè)定APGS的含量。取適量APGS浸膏,并以70%乙醇溶解,分別加入 pH 4.5 NaAc-HCl和p H 1.0 KCl-HCl的緩沖溶液,混勻。靜置2 h后,分別測(cè)定不同p H值下APGS溶液在λmax和700 nm處的吸光值變化。

根據(jù)Fuleki[11]的研究,APGS的得率ω(mg/100g)和APGS的質(zhì)量濃度C(mg/L)的計(jì)算方法如下:

式中:ΔA=(Aλmax-A700)p H1.0-(Aλmax-A700)pH4.5;V為花色苷溶液體積,mL;F為稀釋倍數(shù);av E1%1cm為平均消光系數(shù),98.2[12];m為鮮葡萄皮質(zhì)量,g。

1.2.4 APGS的分離

分別采用紙層析(PC)(層析濾紙為新華3號(hào)濾紙)和硅膠薄層層析(TLC)分離APGS。展開(kāi)劑為m正丁醇∶m冰醋酸∶m水=4∶1∶5,觀察層析斑點(diǎn)顏色變化,計(jì)算其Rf值。

2 結(jié)果與討論

2.1 APGS的呈色反應(yīng)

檢測(cè)發(fā)現(xiàn),APGS的色澤受p H值和一些化學(xué)物質(zhì)的干擾和影響,結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 不同p H值對(duì)APGS的色澤影響Table 1 Effects of p H values on color of APGS

表2 不同化學(xué)物質(zhì)與APGS的呈色反應(yīng)Table 2 Color reactions of APGS with different chemical materials

由表1可見(jiàn),隨著pH值由小變大時(shí),APGS顏色從橙色、紅色、黃色到藍(lán)色逐漸變化,此種顏色變化與文獻(xiàn)報(bào)道的花色素變化規(guī)律相一致[13],初步說(shuō)明APGS為花色苷類色素。同時(shí),APGS色澤的呈現(xiàn)受pH值的影響較大,在一般食品p H值范圍內(nèi)多呈現(xiàn)黃色。而且食品中的某些化學(xué)物質(zhì)或元素也影響花色苷的呈色狀況,見(jiàn)表2。因此在添加了膨松劑(如小蘇打、碳酸氫銨等)及強(qiáng)化鎂、鐵等元素的食品中,APGS的應(yīng)用應(yīng)考慮對(duì)其色澤變化的影響[14]。

2.2 APGS吸收光譜及最大吸收波長(zhǎng)的檢測(cè)

將適當(dāng)質(zhì)量濃度的APGS溶液進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收光譜檢測(cè),測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可知,APGS在紫外區(qū)存在238 nm和281 nm處的2個(gè)最大吸收波長(zhǎng),同時(shí)可見(jiàn)區(qū)也存在539 nm處的最大吸收波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)所得APGS的紫外-可見(jiàn)區(qū)的光譜吸收情況與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13],說(shuō)明APGS中含有花色苷類色素。

2.3 APGS的層析檢測(cè)

為了進(jìn)一步除去APGS浸膏中的極性雜質(zhì),向其中加入3～5倍體積的石油醚,反復(fù)沉淀后,以乙酸乙酯溶劑萃取3次,收集水相,并除去水相中殘留的乙酸乙酯,得APGS水劑產(chǎn)品,冷藏備用。

APGS紙層析結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn),層析紙上自上而下依次出現(xiàn)紫紅色、桃紅色和黃綠色斑點(diǎn),且紫紅色、紅色斑點(diǎn)體積均大于黃綠色斑點(diǎn)體積,表明APGS中紅色色素含量較大,而且由2種以上色素組成。將濾紙條移至紫外燈下觀察,發(fā)現(xiàn)顯紅色的斑點(diǎn)無(wú)明顯變化,而呈黃綠色的斑點(diǎn)呈現(xiàn)黃綠色熒光;將濾紙條再移至氨氣瓶口觀察,紅色斑點(diǎn)呈現(xiàn)為黃色,而黃綠色斑點(diǎn)無(wú)明顯變化。APGS水劑產(chǎn)品經(jīng)紙層析后,自上而下依次出現(xiàn)紫紅色和桃紅色斑點(diǎn),未出現(xiàn)黃綠色斑點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)[15]可推斷,顯紅色斑點(diǎn)的色素屬于花色苷類色素,黃色、黃綠色斑點(diǎn)則是類黃酮類色素,在APGS除雜質(zhì)的過(guò)程中被除去。APGS水劑產(chǎn)品經(jīng)過(guò)薄層層析分離后,硅膠薄層色譜板上出現(xiàn)了粉紅色和紫紅色斑點(diǎn)(圖3),計(jì)算其Rf值分別為0.64和0.85。

紙層析和薄層層析結(jié)果均說(shuō)明:以紫葡萄皮為原料,采用超聲波提取技術(shù)所制得APGS中含有花色苷色素。但其品種不是單一的,進(jìn)一步采用層析分離技術(shù)與質(zhì)譜、核磁等分析手段,明確APGS中花色苷色素的組成,這是筆者今后對(duì)花色苷開(kāi)發(fā)研究的方向之一。

2.4 APGS的定量測(cè)定

APGS在p H值1.0和pH值4.5時(shí)的吸光值結(jié)果見(jiàn)表3。

由1.2.3中公式計(jì)算得 ΔA=0.04,按照Fuleki[11]的pH值示差法測(cè)定APGS的得率和質(zhì)量濃度分別為:

表3 不同p H值下APGS的吸光值Table3 Absorbance of APGS with different p H values

3 結(jié) 語(yǔ)

中國(guó)具有豐富的葡萄資源,而且葡萄飲料和釀酒工業(yè)中存在的大量葡萄皮殘?jiān)?均可制備花色苷色素。因此,葡萄花色苷具有良好的綜合開(kāi)發(fā)前景。考慮到紫葡萄的品種、產(chǎn)地、氣候等因素所引起的花色苷分布的差異性,本實(shí)驗(yàn)中均采用了分布廣泛的杭州產(chǎn)“巨峰”紫葡萄為原料,采用超聲波輔助萃取制備了APGS。通過(guò)光譜學(xué)、紙層析和薄層層析分析,在APGS浸膏中初步發(fā)現(xiàn)了2種以上的呈紅色花色苷色素。pH值示差法測(cè)得APGS中花色苷含量為145 mg/100 g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了超聲波萃取技術(shù)應(yīng)用于花色苷類色素制備的可行性。

[1] 高錦明.植物化學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2003:156-164.

[2] 劉鄰渭.食品化學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2002:156-164.

[3] 丁銳.國(guó)外花色素苷的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].漢中師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004(6):73-79.

[4] 任雁,張惟廣.花色素苷的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食品添加劑,2006(4):71-77.

[5] 龐志申.花色苷研究概況[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,18(5):37-42.

[6] 盧鈺,董現(xiàn)義,杜景平,等.花色苷研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,35(2):315-320.

[7] MANN J.Secondary Metabolism[M].London:Oxford University Press,1987:275-285.

[8] BELL E A.Secondary Plant Products[M].New York:Springer,1980:340-349.

[9] 鄧潔紅,譚興和,潘小紅,等.葡萄花色苷研究進(jìn)展[J].包裝與食品機(jī)械,2006,24(6):22-28.

[10] 方忠祥,倪元穎.花青素生理功能研究進(jìn)展[J].廣州食品工業(yè)科技,2001,17(3):60-62.

[11] FULEKI T,RICARDO DA SILVA J M.Catechin and procyanidin composition of seeds from grape cultivars grown in ontario[J].J Agric Food Chem,1997,45(4):1156–1160.

[12] 徐金瑞,張名位,劉興華,等.黑大豆種質(zhì)抗氧化能力及其與總酚和花色苷含量的關(guān)系[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(8):1545-1552.

[13] HARBORNE J B.黃酮類化合物[M].戴倫凱,等,譯.北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1983.

[14] 古麗伯斯坦.紫葡萄皮色素的理化性質(zhì)研究[J].新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào),2001,20(3):53-57.

[15] SHI Z,BA LSA I A,GABRIELSL,et al.Procyanldins pigment of sweet potatoes-Ipomoea batatas[J].J Food Sci,1992,57(3):755-757.