曹譯心 張 旭 張翠薇 何 穎 馬躍榮△

1(瀘州醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室,瀘州646000)

2(瀘州醫(yī)學院 病理教研室,瀘州 646000)

3(瀘州醫(yī)學院藥學院 中藥學實驗室,瀘州646000)

急性腎功能衰竭(acute renal failure,ARF)是臨床上常見的急危重癥,指由于腎小球濾過率急劇下降引起血尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)上升的一組臨床綜合征。丹參酮ⅡA提取自我國傳統(tǒng)中藥丹參,是丹參中最豐富、結構最具有代表性的丹參酮。在我國丹參酮ⅡA已被用于心肌梗死或心絞痛的患者,具有明顯的療效。這些都與丹參酮ⅡA具有較強的清除自由基和抗脂質氧化作用,抗血小板聚集和抗血栓形成分不開。考慮到丹參酮ⅡA的上述生物學活性,且尚無在ARF中的研究報道,本研究采用甘油肌注致大鼠ARF模型,并應用丹參酮ⅡA進行干預,隨后進行各項腎臟功能損害的指標檢測以及細胞增殖指數的檢測,觀察丹參酮ⅡA對ARF是否具有防治作用。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級、健康9周齡SD大鼠,雌雄不拘,體重180～220g,瀘州醫(yī)學院動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司),Ki-67山羊抗大鼠多克隆抗體(美國Santa Cruz公司出品,購自基因公司)。大鼠Scr和BUN試劑盒(購自上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 64只大鼠分為四組(每組16只):對照組(N)、模型組(M)、丹參酮低劑量組(TL)和丹參酮高劑量組(TH)。根據觀察時間又分為兩個亞組,即甘油注射后48 h組和72 h組。每個時間點8只大鼠。各組大鼠先行禁水24 h,之后對照組大鼠雙下肢肌注生理鹽水10 m l/kg。模型組大鼠雙下肢肌肉注射50%甘油生理鹽水10 m l/kg。丹參酮低劑量組在肌注50%甘油生理鹽水后4 h腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉10m g/(kg?d);丹參酮高劑量組在肌注50%甘油生理鹽水后4 h腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉20m g/(kg?d)。所有大鼠均置于大鼠代謝籠收集24 h尿液。

1.3.2 取材 各組大鼠以1.5%戊巴比妥鈉(40 m g/kg)腹腔麻醉后,腹部正中切開,于下腔靜脈采血,分別注入干管和抗凝管待測,后取右側腎組織以AAF液固定。

1.3.3 生化指標檢測 參照試劑盒流程檢測BUN和Scr數值,考馬斯亮蘭法測24 h尿蛋白定量。

1.3.4 腎組織病理檢查 用AAF液固定的腎組織經脫水、透明、石蠟包埋,切片。行HE染色觀察腎臟病理學改變。

1.3.5 免疫組織化學 采用SP法。陽性細胞計數方法:Ki-67陽性者細胞核染成棕黃色。在腎髓質區(qū)隨機選取20個連續(xù)不重復的200倍視野,計數Ki-67陽性表達的腎小管上皮細胞。

1.4 統(tǒng)計學分析 所有數據均用表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況的變化

對照組大鼠體毛有光澤,反應敏捷,飲食正常;模型組、丹參酮低劑量組和丹參酮高劑量組大鼠經注射甘油生理鹽水后出現精神萎靡不振,反應遲鈍并呈蜷縮狀,體毛無光澤,注射部位局部水腫,食欲差,尿量明顯減少;在大約60 h之后丹參酮高劑量組大鼠一般情況稍好于模型組。

2.2 各項腎功能指標的變化

48 h時對照組的各項病理損害指標均低于其他各組(P＜0.01),模型組、丹參酮低劑量組和丹參酮高劑量組之間無顯著差異(P＞0.05)。72 h時對照組的各項病理損害指標均低于其他各組(P＜0.01),模型組、丹參酮低劑量組之間無顯著差異(P＞0.05),但丹參酮高劑量組明顯低于模型組和丹參酮低劑量組(P＜0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠Scr、BUN和尿蛋白量的變化(±s,n=8)Table 1 The changes of Scr,BUN and urine protein in each group( ±s,n=8)

表1 各組大鼠Scr、BUN和尿蛋白量的變化(±s,n=8)Table 1 The changes of Scr,BUN and urine protein in each group( ±s,n=8)

注:*:P＜0.01,與對照組比較;△:P＜0.05,與對照組、模型組和低劑量組比較。

Group Src(μmol/L)BUN(mmol/L)24h U rine p rotein(mg/L)48h 72h 48h 72h 48h 72h N 75.46±10.16 85.59±11.37 6.41±0.95 6.74±1.02 1.00±0.15 1.28±0.28 M 528.81±92.62* 722.44±77.02* 34.36±6.69* 49.54±3.39* 15.48±2.89* 29.93±6.27*TL 472.92±62.32* 673.06±102.59* 31.43±5.62* 45.11±6.74* 12.90±2.12* 24.97±4.09*TH 447.98±105.59* 485.57±77.90*△ 30.64±6.93* 34.05±4.04*△ 11.97±3.60* 21.03±2.95*△

2.3 病理組織學改變

肉眼觀察:對照組大鼠腎臟大小、色澤正常;模型組、丹參酮低劑量組和丹參酮高劑量組大鼠雙腎明顯變大,色呈灰白色,表面有出血點,切面可見皮質較蒼白,髓質紅。光鏡下,對照組大鼠腎小管基底膜完整,腎小管上皮細胞結構清晰,未見變性壞死,腔內未見管型。模型組、丹參酮低劑量組和丹參酮高劑量組在第48 h、72 h,均可見小管上皮細胞嚴重變性、崩解和脫落,腎小管管腔擴張,蛋白管型易見,少數大鼠可見間質水腫,伴炎性細胞浸潤;但丹參酮高劑量組的腎組織損傷程度較模型組、丹參酮低劑量組輕(尤其是72 h組)(見圖1)。

2.4 丹參酮IIA對腎小管上皮細胞增殖的影響

光鏡下,對照組大鼠腎組織僅見少量腎小管上皮細胞核Ki-67陽性;其余各組均出現一定程度的腎小管上皮細胞增殖(見圖2)。在48 h及72 h:對照組的K i-67陽性細胞計數均低于其他各組(P＜0.05);模型組、丹參酮低劑量組之間無顯著差異(P＞0.05);但丹參酮高劑量組明顯高于模型組和丹參酮低劑量組(P＜0.05)(見圖2、圖3)。

圖3 各組大鼠K i-67陽性細胞計數(±s,n=8)*:與對照組比較,P＜0.05;△:與模型組和低劑量組比較,P＜0.05Fig.3 The K i-67 positive cell count in each group(±s,n=8)*:Comparewith N,P＜0.05;△:Comparewith M and TL,P＜0.05

3 討論

ARF是臨床上較為常見的危重病癥,ARF的病死率高達50%以上。導致ARF最主要的原因是急性腎小管壞死,缺血和中毒所致的急性腎小管壞死。ARF時會由于腎小球濾過率急劇下降而引起B(yǎng)UN、Scr和24 h尿蛋白明顯上升,而這幾項指標同時也是反映ARF功能變化的最敏感指標。本實驗給大鼠肌肉注射甘油生理鹽水后出現少尿,BUN、Scr和24 h尿蛋白明顯增高,同時從形態(tài)學上可見大鼠注射甘油后腎小管壞死明顯。說明該模型能很好模擬ARF的病變。

我國傳統(tǒng)中藥丹參具有活血化淤的作用,過去常常應用于心血管疾病的治療,但目前其在腎臟病方面的研究及應用還很有限。丹參酮ⅡA是從丹參中提取出來的最具代表性的有效藥理成分,具有廣泛的藥理作用。丹參酮ⅡA磺酸鈉是丹參酮ⅡA經磺化而成的水溶性鈉鹽。現已證明丹參酮ⅡA具有較強的清除自由基和抗脂質氧化作用,同時還可以抗血小板聚集和抗血栓形成。

本研究發(fā)現,丹參酮高劑量組在72 h可以顯著改善ARF大鼠各項生化指標,并且對病理組織學改變也有一定的改善作用,而類似的情況在48 h并未發(fā)生。說明較高濃度丹參酮IIA的使用可以改善ARF導致的腎功能損害,但是這種改善效果要經歷一定時間以后才會顯現出來。上述現象推測可能與下列機制有關:

(1)復制動物模型時禁水及注射甘油形成的高滲透壓造成肌組織損傷,大量液體聚集于損傷的肌肉組織中,使有效循環(huán)血量減少,腎血流量減少。而在缺血缺氧的情況下,腎組織內會積聚較多的氧自由基和脂質過氧化物,它們可以造成生物膜系統(tǒng)損傷以及細胞內氧化磷酸化障礙,導致相應的臨床表現和形態(tài)學改變。缺血缺氧時腎臟組織氧自由基的增多和下列系統(tǒng)的異常有關:①黃嘌呤氧化酶系統(tǒng);②線粒體呼吸鏈系統(tǒng);③前列腺素代謝和活化白細胞途徑;④兒茶酚胺氧化途徑;⑤細胞內抗氧化酶活性下降,抗氧化物質含量降低,使氧自由基相對增高。而丹參能通過多種途徑清除氧自由基,丹參對氧自由基的清除作用已從多種實驗得到證實[1,2,3]。丹參清除氧自由基的作用機制在于:①能明顯降低血清脂質過氧化物(LPO)含量,提高血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性;②減少氧自由基的產生。此外,丹參酮ⅡA是一種有效的細胞內脂質過氧化產物與 DNA互相作用的抑制物,它對DNA的保護作用可能是通過清除脂類自由基,阻斷脂質過氧化的鏈式反應,從而抑制DNA加成物的生成以減少細胞毒性。所以,推測丹參酮ⅡA可能是通過清除缺血缺氧時腎臟組織增多的氧自由基和脂質過氧化物而達到減輕ARF時的腎小管損害和改善腎功能的作用。

(2)隨著有效循環(huán)血量減少,腎血流量減少、血液黏度增加,增加腎組織血栓形成的幾率。而丹參酮ⅡA具有降低血液黏滯性,延緩血液凝固和拮抗血小板活化因子等作用[4,5]。推測丹參酮ⅡA通過上述途徑改善了ARF大鼠腎臟乃至全身的血流動力學狀況而改善了其全身狀況及ARF所致的臨床表現。

(3)復制動物模型時禁水及甘油的高滲透壓還可造成肌肉及肌肉血管的溶解,釋放其降解產物引起腎小管上皮細胞的損傷。在減輕這些有害物質對腎小管上皮的損害過程中,丹參酮ⅡA是否發(fā)揮了積極的作用在本實驗中未作研究,但是,通過我們的實驗發(fā)現:丹參酮IIA高劑量組腎小管上皮細胞的Ki-67陽性細胞數明顯高于其他各組,說明丹參酮IIA具有促進腎小管上皮細胞增殖再生的作用。這提示丹參酮IIA可能可以間接的(通過改善腎臟的血液循環(huán)狀況)促進再生;或者直接地促進再生。

綜上所述,丹參酮IIA對ARF時急性損傷的腎小管上皮細胞具有減輕病變和促進再生修復的作用,可改善ARF大鼠的腎功能。但其具體機制有待進一步研究。

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