劉佩 阮暉 沈生榮 周倩 馬鎏鏐 何國慶

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310019)

共軛亞油酸(CLA)是由亞油酸(LA)衍生的一組亞油酸異構(gòu)體，因具有諸多的生理功能(如抗癌、調(diào)節(jié)機體免疫、減肥以及預(yù)防糖尿病等)而備受關(guān)注［1］.CLA異構(gòu)體繁多，目前已檢測到的多達28種，而其中具有生物活性的異構(gòu)體主要是c9，t11-CLA和 t10，c12-CLA［2］.

目前，有關(guān)生物異構(gòu)化法合成CLA的研究日益增多，而獲得高純度、高活性異構(gòu)體含量的CLA逐漸成為研究的主要目標.在CLA生物法合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶是亞油酸異構(gòu)酶(LAI)，最早在反芻動物瘤胃的溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)中被發(fā)現(xiàn)［3］，之后在許多瘤胃細菌中也檢測到了LAI活性［4-8］，但其大都是厭氧菌株，對環(huán)境要求苛刻，難以培養(yǎng)，而且LAI的分離純化相對困難，因而應(yīng)用價值大大降低.隨后，人們相繼發(fā)現(xiàn)，許多乳酸菌菌株，包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、德氏乳酸桿菌乳亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等都具有 LAI活性［9］，其中乳酸菌菌株易于培養(yǎng)且大多食用安全，其研究和應(yīng)用價值逐漸凸顯.

Cahoon 等［10］最早從苦瓜(Momordica charantia)和鳳仙花(Impatiens balsamina)中克隆得到兩個酶基因，這兩個酶(又被稱為共軛酶)能夠?qū)A C-12位上的雙鍵轉(zhuǎn)變?yōu)镃-11和C-13位共軛雙鍵.隨后許多l(xiāng)ai基因得以克隆并公布:Stanton等［11］對短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)lai基因進行了擴增和序列測定(AX647943)，基因全長1 985 bp，編碼625個氨基酸;Rosson等［12］分別完成了對 Lactobacillus reuteri和痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)lai基因的克隆及測序;此外，一些菌株如加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、詹士乳桿菌(Lactobacillus johnsonii NCC533)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、羽狀翼藻(Ptilota filicina)的lai基因也相繼在Genbank中公布.隨著對lai基因的擴增和分析，對其異源表達的研究也逐漸展開，然而目前對乳酸菌來源的lai基因的展示表達以及基因工程菌的改造和構(gòu)建等還較少研究.

文中對植物乳桿菌(L.plantarum)lp15-2-1株［13］的lai基因進行擴增，并對其編碼序列進行比對分析，隨后通過構(gòu)建酵母展示表達載體，展示表達重組LAI，并初步分析其酶活以及產(chǎn)物CLA的構(gòu)成，以期獲得具有較高酶活的酵母工程株，為生物合成CLA的工業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

植物乳桿菌(L.plantarum)lp15-2-1株為筆者所在實驗室誘變選育［13］，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏號為CGMCC No.3782);大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α購自美國Invitrogen公司;釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)K601 株(基因缺失型菌株——ade2、his3、leu2、trp1、ura3 5個基因缺失)和酵母表達載體pYES2(ura3、galp、cycit、amp)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄭成超實驗室惠贈.

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基主要為溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨半乳糖(YPG)培養(yǎng)基(酵母提取物1%、蛋白胨2%、半乳糖2%，pH=7.0)、尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型(SD-Ura)培養(yǎng)基(Ura-Do Supplement 0.077%、無氨基酵母氮源0.67%、半乳糖 2%)和乳酸細菌(MRS)培養(yǎng)基［13-14］.

1.3 主要試劑和引物

主要試劑和引物包括:ExTaq DNA聚合酶、dNTP、氨芐青霉素(Amp+)、DL2000和 DL15000 DNA標記物以及pMD 18-T simple載體(pMDS)(Takara-寶生物工程大連有限公司)，溶菌酶、胰蛋白胨、酵母提取物、溴乙錠、十六烷基硫酸鈉(SDS)、葡萄糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯酚、氯仿和異戊醇等(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，瓊脂糖、質(zhì)粒DNA提取試劑盒(美國Omega公司)，LA、CLA標樣(美國Sigma公司).

根據(jù)Genbank中酵母信號肽(No:YPL187W)編碼序列、凝集素基因(No:YJR004C)序列、植物乳桿菌WCFS1基因組全序列(No:NC004567)和羅伊氏乳桿菌 lai基因(No:AX062045)［12］設(shè)計引物，詳見表1，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.

表1 實驗所用引物序列Table 1 Primer sequences in the study

1.4 實驗方法

1.4.1 植物乳桿菌和釀酒酵母基因組DNA的提取

植物乳桿菌培養(yǎng)方法及基因組DNA的提取參見文獻［13］.

釀酒酵母K601于YPD培養(yǎng)基中、30℃下振蕩培養(yǎng)過夜.酵母基因組DNA的提取方法為:取5mL菌液，1000g離心5min;用無菌水洗滌細胞，3000g離心5min，棄上清;將細胞懸浮于0.5mL山梨醇緩沖液中(山梨醇1mol/L，Na2EDTA 0.1mol/L，pH=7.5)，加入20μL溶菌酶(10g/L)，37℃下溫育1h;加入200μL 2%(體積分數(shù))的SDS，-20℃下放置30 min后，于高溫水浴中使菌液迅速溶解，反復(fù)操作3次;加1/10體積的5mol/L KAc(pH=8.0)，混勻后10000g離心10min;將上清轉(zhuǎn)至新的離心管中，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20℃下放置5～10 min;12000g離心 5 min，去上清，采用 500 μL TE(Tris-EDTA緩沖溶液)回懸菌體后，加10 μL RNA酶A，37℃下溫育30min;加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25∶24∶1)抽提兩次，12000g離心5min后，將上清轉(zhuǎn)至新的離心管中;加1/10體積的5mol/L NaAc和0.8倍體積的異丙醇，室溫放置20min后，12000g離心10min，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀兩次，室溫晾干后，加入100μL TE緩沖液(pH=8.0)回溶，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.4.2 基因擴增及克隆載體的構(gòu)建

分別以植物乳桿菌lp15-2-1和釀酒酵母K601基因組DNA為模板，進行PCR擴增，反應(yīng)體系為:10×PCR 緩沖液(含 Mg2+)5μL，dNTPs(25mmol/L)4μL，引物 1 和引物 2(10 μmol/L)各 1 μL，基因組DNA 1 μg，ExTaqDNA 聚合酶 1 U，加無菌超純水至終體積50μL;PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30s，48℃退火30s(基因 mfα1)/50℃退火40s(基因lai和酵母凝集素C端含321 aa的錨定區(qū)序列sag)，72℃延伸1min，反應(yīng)30個循環(huán);72℃延伸5min.將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMDS連接，連接產(chǎn)物于16℃反應(yīng)過夜后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含0.1 g/L Amp+的LB平板上，37℃下倒置培養(yǎng)18～24 h，挑取單菌斑于LB(含0.1g/LAmp+)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并分別提取質(zhì)粒(pMDS-lai、pMDS-mfα1 和 pMDS-sag)DNA進行PCR和酶切鑒定.

1.4.3 酵母展示表達載體的構(gòu)建

酵母展示表達載體的構(gòu)建過程為:先用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒pMDS-mfα1和空載體pYES2，回收基因片段mfα1和載體pYES2并連接，構(gòu)建pYES2-mfα1(pYM)載體;再用 EcoRⅠ和 XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒pMDS-lai和pYM，回收lai基因片段并將之插入載體 pYM 中，構(gòu)建 pYES2-mfα1-lai(pYML)載體;最后用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切質(zhì)粒pMDS-sag和pYML，分別回收并連接基因片段sag和載體pYML，構(gòu)建酵母展示表達載體 pYES2-mfα1-lai-sag(pYMLS)，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示.

圖1 pYMLS結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of pYMLS structure

1.4.4 電擊法轉(zhuǎn)化酵母及轉(zhuǎn)化子的篩選

電擊法轉(zhuǎn)化釀酒酵母的具體方法參見文獻［14］，轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在SD-Ura平板上，于30℃下倒置培養(yǎng)48～72h后，挑取單菌斑做PCR鑒定.菌落 PCR鑒定使用引物 LAI-5＇和 LAI-3＇，能擴增出預(yù)期大小條帶(1700 bp)的菌落即為已經(jīng)含有質(zhì)粒pYMLS的酵母工程菌株.

1.4.5 酵母工程菌株細胞及細胞壁的制備

將酵母工程菌株接種于5 mL新鮮的SD-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃、180r/min下振蕩培養(yǎng)過夜;分別取100μL菌液接種于10 mL YPG(含有2%的半乳糖，作為誘導(dǎo)劑)液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min下分別振蕩培養(yǎng)0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66和72h時收集菌液，于4℃、3000g下離心5min，分別收集上清液和酵母細胞;用生理鹽水(0.9%NaCl溶液)洗滌細胞兩次后，再用0.1mol/L的磷酸緩沖液(PBS)重懸酵母細胞，調(diào)整D(600)=2.0.取上述培養(yǎng)48 h的酵母工程菌制備的PBS菌懸液30mL進行酵母細胞壁組分和細胞質(zhì)組分的分離和提取，具體方法參見文獻［15］.

1.4.6 LAI酶活的測定

分別往含有不同提取物(上清液、酵母細胞、細胞壁提取物、細胞質(zhì)提取物)的10mL PBS緩沖液中添加LA(終質(zhì)量濃度達3 g/L)，30℃下振蕩培養(yǎng)20h，測定CLA的含量并計算酶活.LAI的酶活力單位(U)為每1 h產(chǎn)1 μg CLA所需要的酶量.CLA的萃取、甲酯化以及氣相檢測方法參見文獻［13］.

2 結(jié)果及分析

2.1 lai基因的擴增及序列分析

使用引物L(fēng)AI-5＇和LAI-3＇，以植物乳桿菌 lp15-2-1基因組DNA為模板進行PCR擴增，所得目的基因lai片段長度為1700bp左右;將PCR產(chǎn)物與載體pMDS連接，構(gòu)建了克隆載體pMDS-lai，基因的PCR擴增及質(zhì)粒的雙酶切(EcoRⅠ和XhoⅠ)電泳檢測結(jié)果見圖2(a).

經(jīng)測序得知lai基因全長1695 bp，編碼565 aa，在Genbank上的注冊號為HQ831447.將其編碼序列在Blast(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上搜索，得知該序列與不同來源的肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原(MCRA)蛋白同源性極高:與植物乳桿菌(ZP_07076736)為99.7%，與短乳桿菌 (YP_794478)為84.3%，與干酪乳桿菌 ATCC 334(YP_805714)和BL23(ZP_001986473)為79.5%，與酒類酒球菌PSU-1(YP_811225)為51.8%，而與紅串紅球菌的LAI(ZP_04386005)同源性為52.7%，與來源于痤瘡丙酸桿菌的 C9型異構(gòu)酶的 PAI同源性僅有11.26%.對PAI的研究表明，該酶屬于C9型，主要轉(zhuǎn)化LA 為t10，c12-CLA［16］;而其氨基酸序列含有黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合基序(GxGxxGx(17-19)E)，有利于FAD的結(jié)合，從而在異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化合成CLA過程中發(fā)揮作用，且FAD的結(jié)合很有可能在蛋白的加工折疊過程中就已經(jīng)完成［17］.LAI與不同來源的MCRA蛋白N端的同源性比較如圖3所示，來源于植物乳桿菌的LAI的 N端有一個半保守的FAD結(jié)合基序(GxGxxNx(15)K/D/E).此結(jié)果表明，該酶的作用可能也需要FAD的結(jié)合，但由于結(jié)合基序的差異，使得FAD與酶分子的結(jié)合方式及結(jié)合力度與PAI可能并不相同.

圖2 基因lai、mfα1及sag的PCR擴增和克隆載體的酶切電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoretograms of PCR amplification of lai，mfα1 and sag genes and restriction analysis of cloning vectors

圖3 LAI及MCRA蛋白的FAD結(jié)合基序的同源性比較Fig.3 Homology analysis of FAD binding motif of LAI and other MCRA proteins

2.2 酵母展示表達載體的構(gòu)建

以提取的釀酒酵母K601基因組DNA為模板進行PCR擴增，電泳檢測結(jié)果見圖2(b)，分別擴增得到了267 bp(mfα1)和963bp(sag)的片段，完全符合預(yù)期值.將所得PCR產(chǎn)物與pMDS克隆載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選得到質(zhì)粒pMDS-mfα1和pMDS-sag，提取質(zhì)粒 DNA后分別進行酶切鑒定(HindⅢ和EcoRⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ)，結(jié)果見圖2(c)，圖中顯示均切出了符合預(yù)期大小的條帶.通過一系列的酶切以及連接反應(yīng)，分別將mfα1和sag連接在基因 lai的兩側(cè)，并最終將 mfα1-laisag融合基因片段插入到了酵母表達載體pYES2中，構(gòu)建了酵母展示表達載體pYMLS.分別用HindⅢ和EcoRⅠ、HindⅢ和XhoⅠ以及 HindⅢ和 XbaⅠ對表達載體進行雙酶切鑒定，電泳檢測結(jié)果如圖4所示，分別檢測到 267 bp(mfα1)、1962bp(mfα1+lai)和2925bp(mfα1+lai+sag)的條帶，表明表達載體已經(jīng)構(gòu)建成功.

圖4 酵母展示表達載體pYMLS的酶切電泳圖Fig.4 Electrophoresis analysis of digested yeast cell-surface expression vector pYMLS

2.3 酵母工程菌的PCR鑒定

使用電擊法將pYES2空載體及表達載體pYMLS轉(zhuǎn)入酵母K601中，利用尿嘧啶缺失型培養(yǎng)基進行酵母工程菌株的初篩，之后使用引物L(fēng)AI-5＇和LAI-3＇進行菌落PCR鑒定酵母轉(zhuǎn)化子，部分酵母工程菌株的PCR鑒定結(jié)果見圖5.其中除對照菌株外，13株酵母工程菌株中都檢測到了預(yù)期大小(約1700bp)的條帶，表明尿嘧啶缺失型培養(yǎng)基上篩選得到的酵母工程菌株中均含有表達載體pYMLS.

圖5 酵母工程菌株的PCR鑒定Fig.5 Identification of genetically engineering yeast by PCR

2.4 CLA異構(gòu)體的分析與檢測

圖6 酵母工程菌株CLA產(chǎn)物的氣相色譜圖Fig.6 GC chromatograms of CLA produced by genetically engineering yeast

氣相色譜法對LA和CLA甲酯標樣的檢測結(jié)果如圖6所示.由圖6可見，LA的出峰時間為30.46min，而CLA中的兩種異構(gòu)體 c9，t11-CLA和 t10，c12-CLA得到了較好的分離，其保留時間分別為32.62和32.83min.利用氣相色譜分析法對酵母工程菌株細胞合成CLA產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有空載體pYES2的陰性對照菌株培養(yǎng)液中并沒有明顯的CLA產(chǎn)生;而含有酵母展示表達載體pYMLS的酵母工程菌株培養(yǎng)液催化LA后，產(chǎn)物在保留時間為30.28和32.45min時出現(xiàn)典型峰，比對標準品的保留時間得知，二者分別為LA和c9，t11-CLA;含有質(zhì)粒pYMLS的酵母工程菌株的培養(yǎng)液中檢測到了CLA的存在，表明lai基因在酵母中展示表達成功，且LAI能夠?qū)A轉(zhuǎn)化為單一的c9，t11-CLA異構(gòu)體.

2.5 LAI的定位及酶活測定

為了檢測酵母工程菌株中LAI的定位，分別對誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h的酵母工程菌株上清液、酶母細胞、細胞壁提取物和細胞質(zhì)提取物進行酶活測定，結(jié)果見表2.對照菌株(K601/pYES2)各種組分中均未檢測到LAI活性，而在6株轉(zhuǎn)有pYMLS的工程菌株(K601/pYMLS)中(表2中1-6號)，分別在酵母細胞和細胞壁提取物中檢測到了LAI的活性，酶活最高達40.5 U/mL，并且酵母細胞和細胞壁提取物中的酶活基本一致，表明酵母工程菌株中LAI已經(jīng)成功在酵母細胞表面展示表達.因此在對酵母工程菌株的后期研究以及應(yīng)用過程中，可直接收集酵母細胞進行酶活測定以及CLA的合成，避免了細胞生長過程中添加LA而產(chǎn)生的毒害作用以及細胞將LA作為碳源而造成的消耗.

隨后，選取1號酵母工程菌株，分別在YPG誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～72 h，收集酵母細胞，檢測LAI酶活的變化，結(jié)果見圖7.由圖7可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，酶活逐漸增加，在48 h時達到最大，為40.5U/mL;隨后酶活逐漸降低，這可能是由于培養(yǎng)時間的延長，致使培養(yǎng)基中發(fā)揮誘導(dǎo)作用的半乳糖被酵母細胞逐漸消耗，以及工程菌株中質(zhì)粒在無選擇壓力的情況下丟失［18-19］.此外，與植物乳桿菌lp15-2-1 LAI天然酶活(14.2 U/mL)相比［20］，工程菌株的最大酶活增長了約1.9倍;與C9型PAI相比，異源表達PAI的酵母以及煙草中并未檢測到CLA，即PAI經(jīng)異源表達后并無酶活，而其編碼序列按照酶母中的密碼子偏好性經(jīng)密碼子優(yōu)化后得到CoPAI，CoPAI經(jīng)異源表達后有酶活，能夠轉(zhuǎn)化LA合成微量的 CLA，且產(chǎn)物為 t10，c12-CLA［16］，本研究展示表達在酵母細胞表面的 LAI能夠轉(zhuǎn)化合成c9，t11-CLA異構(gòu)體，該酶很可能作用于LA的C-12位，屬于C12型異構(gòu)酶.因此也許可以通過對半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)條件的摸索、對表達載體誘導(dǎo)啟動子的改進或更換以及對LAI編碼序列進行密碼子的優(yōu)化等方法，進一步增強基因的表達進而提高酶活力.此研究為探討LAI的作用機制和繼續(xù)構(gòu)建乳酸菌展示表達載體，以及在乳酸菌中展示表達LAI奠定了良好的理論基礎(chǔ).

表2 酵母工程菌株不同組分中LAI酶活的分布1)Table 2 Distribution of LAI activities in different components of genetically engineering yeast

圖7 酵母工程菌株LAI酶活-時間曲線Fig.7 Time course of LAI activity in genetically engineering yeast

3 結(jié)語

文中成功地從植物乳桿菌lp15-2-1基因組DNA中擴增得到全長1 695 bp的 lai基因，編碼565aa，基因編碼序列的N端存在一個半保守的FAD結(jié)合基序GxGxxNx(15)K/D/E;隨后通過構(gòu)建酵母展示表達載體、電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母K601，首次獲得了展示表達LAI的酵母工程菌株.對工程菌株細胞不同組分酶活的測定表明，LAI成功地展示在了酵母細胞表面，最高酶活達40.5U/mL，并能夠轉(zhuǎn)化LA為單一的c9，t11-CLA異構(gòu)體.通過LAI的展示表達，不僅避免了表達產(chǎn)物的胞內(nèi)降解，減少了酶分離純化的步驟，也大大簡化了產(chǎn)物CLA的分離提取過程，為CLA的工業(yè)化生產(chǎn)以及在食品上的應(yīng)用打下了基礎(chǔ).同時，本研究也為進一步將lai基因在食品級微生物中表達、生產(chǎn)單一的CLA異構(gòu)體、開發(fā)保健功能性食品等提供了可能.

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