鄭衍芳,李艷君,趙 勇,李嘯紅,黃昕燕,王志群

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室,廣東珠海 519041;2.佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

N SCs是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中特殊的細(xì)胞群,是能夠在適當(dāng)?shù)奈h(huán)境中分化產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的一類多能干細(xì)胞。近年來,一些研究表明移植神經(jīng)干細(xì)胞治療急、慢性脊髓損傷以及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本實驗就冬蟲夏草在促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化的作用進(jìn)行了初步的探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞所用動物新生24h內(nèi)的 Wistar大鼠,灌胃取血清體重平均為200g的 Wistar大鼠均為佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供。冬蟲夏草菌絲體購自杭州中美華東制藥有限公司。

1.2 冬蟲夏草含藥血清的制備

隨機(jī)選取體重約200g的 Wistar大鼠分四組,每組 8只,適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后,分別給予冬蟲夏草水提液 0.5g/kg˙d,0.75g/kg˙d,1g/kg˙d分兩次灌胃,對照組予以等量的生理鹽水灌胃。灌胃14d,第14天早灌胃1h后,將大鼠進(jìn)行乙醚麻醉后,行內(nèi)眥采血,分離血清 ,56℃水浴30min滅活 ,放-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 N SC的分離培養(yǎng)與傳代

(1)N SCs的原代培養(yǎng):取新生 Wistar大鼠兩只在無菌條件下斷頭取腦,用彎頭鑷子取海馬組織,放入盛 Hank's液的培養(yǎng)皿,漂洗三次后,剪成大小約1mm3組織塊,加入胰酶消化成乳糜狀,10%胎牛血清0.5mL終止消化,200目過濾網(wǎng)過濾,取過濾液離心,棄上清液 ,加入適量完全培養(yǎng)液,用拋光的長頸吸管吹打成單細(xì)胞懸液 ,調(diào)整細(xì)胞為1× 105個 /mL,接種到含 EGF,bFGF,B27的 DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,放入37°、5%CO2、濕度80%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況 ,每3d半量換液一次,7d左右進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

(2)NSCs的傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng)7d后,低倍鏡下觀察,細(xì)胞鋪瓶率達(dá)到80%～ 90%,克隆球直徑約為200μm時進(jìn)行分瓶傳代。在無菌操作下用拋光的長頸吸管將克隆球連同培養(yǎng)液一同移入離心管,放入離心機(jī)中以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min,棄上清液,機(jī)械分離神經(jīng)球為單細(xì)胞懸液,在倒置顯微鏡下計數(shù)臺盼藍(lán)染色后活細(xì)胞比例后,以5× 105個 /mL的密度分裝,傳代培養(yǎng),每隔3d半量換液1次,隔7d傳代1次。

1.4 N SC的 Nestin鑒定

NSCs的 Nestin鑒定傳代三次后的神經(jīng)球接種到含DMEM/F12培養(yǎng)基的24孔板上(板上涂布 0.01%多聚賴氨酸),24h內(nèi)行 Nestin細(xì)胞免疫組化檢測。

1.5 N SC的誘導(dǎo)分化

將傳三代后的神經(jīng)干細(xì)胞球分4組,每組8孔,以細(xì)胞為1× 105個 /mL的密度接種在賴氨酸包被的24孔板上 ,實驗組用 DMEM/F12培養(yǎng)液加10%低,中,高劑量的藥物血清,對照組用 DMEM/F12培養(yǎng)液加10%的鼠血清在37℃、5%CO2、80%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3d半量換液,每天觀察細(xì)胞生長情況,培養(yǎng)7d進(jìn)行 N SE、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.6 免疫組化

對藥物誘導(dǎo)7d的神經(jīng)干細(xì)胞分別進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 ,一抗 (Nestin1:400;NSE1:200;GFAP1:200)。NSE免疫細(xì)胞化學(xué)中,每孔蓋玻片隨機(jī)選取 10個不重疊視野,在100倍鏡下計數(shù)單位視野陽性細(xì)胞數(shù)通過計數(shù)陽性細(xì)胞率檢測神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)觀察原代培養(yǎng)2h單細(xì)胞均勻懸浮在培養(yǎng)液中(圖1),7d可見肉眼可見較多的神經(jīng)球聚集,液體透明。鏡下觀察,神經(jīng)球比較多,背景干凈,球散在培養(yǎng)液中,球中央至外周均透明,折光度好,邊界清晰 (圖2)。

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞 Nestion免疫染色觀察

經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色,神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記性蛋白 Nestin在原代及傳代培養(yǎng)的神經(jīng)球均有表達(dá)(圖3),胞漿及突起呈黃褐色。將貼壁的神經(jīng)球培養(yǎng)一周后,對分化的神經(jīng)樣細(xì)胞分別進(jìn)行 NSE(圖 4),GFAP(圖5)免疫組化,鑒定結(jié)果顯示陽性,神經(jīng)元胞體近橢圓形,核較大、呈圓形 ,有一較長的突起,膠質(zhì)細(xì)胞胞體多呈多角形或長梭形,核小 ,突起較多而短。從而驗證了培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞有增值分裂的特性。

2.3 冬蟲夏草含藥血清誘導(dǎo) NSCs增殖分化的檢測結(jié)果

冬蟲夏草含藥血清添加到三代后的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),24h內(nèi)開始貼壁,克隆球的周緣開始有偽足形成,3d后突觸交織,神經(jīng)樣細(xì)胞移出神經(jīng)球,7d后,神經(jīng)元細(xì)胞胞體逐漸增大,飽滿,突觸增長,神經(jīng)元細(xì)胞分散移出 ,胞體飽滿 ,折光性好,突觸增長變粗 (NSE圖 6～ 9)。免疫組化顯示分化后NSE陽性細(xì)胞,與對照組相比冬蟲夏草含藥血清低,中濃度組分化 N SE細(xì)胞較多 (P＜0.01),而高濃度組細(xì)胞無明顯差異 (P＞ 0.05)。

表1 各實驗組誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞7d后神經(jīng)元胞體周長及面積的測量 ±s,n=10)

表1 各實驗組誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞7d后神經(jīng)元胞體周長及面積的測量 ±s,n=10)

a:P＜0.01;:bP＜0.01;c:P＞ 0.05。

組別 周長(um) 面積(um2)對照組 114.50± 6.79151.15± 18.82低濃度藥物血清組 145.71±5.17a 248.10±29.26a中濃度藥物血清組 142.23±6.54b 239.19±26.23b高濃度藥物血清組 118.91±6.54c 167.63±16.74c

3 討論

N SCs的特異性標(biāo)志抗原是神經(jīng)巢蛋白,或稱神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(Nestin),該基因在未分化的神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá),分化后成熟的神經(jīng)細(xì)胞不表達(dá),因而是 NSCs的特異性標(biāo)志物.研究的原代、傳代培養(yǎng)細(xì)胞,Nestin免疫組化呈陽性反應(yīng),具有神經(jīng)干細(xì)胞的這一特征。神經(jīng)干細(xì)胞最突出的兩個特點是具有自我更新能力,可通過不對稱細(xì)胞分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞。本實驗利用 BrdU(溴脫氧尿苷),單抗標(biāo)記技術(shù),陽性表達(dá)細(xì)胞為 S期細(xì)胞或分裂增殖產(chǎn)生的新生細(xì)胞,表明本實驗分離培養(yǎng)的細(xì)胞群具有分裂增殖,自我更新的能力。動物灌服中藥后,提取血清用于體外實驗是日本學(xué)者 Hiriko Iwama首先提出的[1]。該方法更接近于體內(nèi)實驗。一些研究[2～4]表明:NSCs自然分化為神經(jīng)元的比例非常低。本實驗各試驗組促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的數(shù)量均高于對照組,且神經(jīng)元樣細(xì)胞的面積、周長均大于對照組,這無疑是冬蟲夏草水溶液發(fā)揮的藥理作用。冬蟲夏草含有18種氨基酸,其中包括谷氨酸,甘氨酸,作為微環(huán)境中的一員也參與對神經(jīng)干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)。從冬蟲夏草中分得腺嘌呤、腺苷、胸腺嘧啶、尿嘧啶、尿苷、脫氧腺苷和蟲草素(3'-去氧腺嘌呤核苷)等核苷類成分 ,尤以腺苷具有明顯的藥理作用[5]?？梢哉{(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性。促進(jìn)胞內(nèi) cAM P的增加,從而激活cAMP介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,進(jìn)而引起細(xì)胞的分化。實驗證明[6～8]各種糖蛋白、黏蛋白組成通過調(diào)節(jié)黏著和遷移能力,以及與細(xì)胞外基質(zhì)中各種生長因子和細(xì)胞因子的結(jié)合,來影響 NSCs的增殖和分化。蟲草中的蟲草素和 D-甘露醇可以清除自由基[9],起到抗氧化的作用。近年的一系列研究表明,細(xì)胞內(nèi) ROS水平的輕微增高促進(jìn) NSCs的增殖和分化,而胞內(nèi) ROS水平的顯著增高則快速觸發(fā) NSCS的凋亡。由此推斷,冬蟲夏草能通過上述幾個方面促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,并對所分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞有良好的促發(fā)育作用。由于血清成分復(fù)雜,冬蟲夏草的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,但我們利用冬蟲夏草分化出較多的神經(jīng)元細(xì)胞,這一結(jié)果為冬蟲夏草治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病提供了實驗依據(jù),為臨床應(yīng)用打下了理論基礎(chǔ)。

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