鮑文華,許 君,閻紅娥,孫云暉

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科,黑龍江 佳木斯 154003)

慢性肺源性心臟病(CPHD)是一種多病因、發(fā)病機制復(fù)雜化的疾病,呈慢性進行性發(fā)展,嚴重危害人類健康。近年來,細胞因子在其發(fā)病中的作用逐漸受到重視。一種新的CD4+T細胞亞群(Th17細胞亞群)成為研究的熱點[1]。據(jù)報道 Th17細胞在自身免疫性疾病,防御多種病原體感染、介導(dǎo)慢性炎癥等疾病中發(fā)揮重要作用[2,3],但在 CPHD的研究各文獻中尚未見報道。本實驗將利用流式細胞技術(shù)檢測 Th17細胞在 CPHD患者外周血中的表達,為進一步探討 CPHD的發(fā)病機制及尋求新的治療方法,減少病死率提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇標準

按第三次全國肺心病會議制定的慢性肺源性心臟病診斷標準選擇患者;排除入院前曾口服或靜脈給予激素治療者,合并糖尿病,肝炎,肺結(jié)核,冠心病,心肌病 ,腫瘤,甲狀腺功能亢進者,自身免疫性疾病患者等;對照組選擇體檢健康者。

1.2 一般資料

選擇佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科2010-11～2011-07住院的 CPHD 患者 34例 ,女 20例 ,男 14例 ,年齡 48～81歲,平均(61.50±10.90)歲。剛?cè)朐夯颊呒毙约又仄跒榧又仄诮M,經(jīng)治療好轉(zhuǎn)即將出院患者為緩解期組。對照組20例,男 9例 ,女 11例 ,年齡 45～ 72歲 ,平均 (57.35± 8.46)歲 ,為同期體檢健康者。本研究爭得本院倫理委員會支持,研究對象知情,同意配合。

1.3 試劑與儀器

主要試劑:異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人 CD4抗體;藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人 IL-17A抗體;Mouse IgG1PE同型對照抗體;固定ㄍ透膜試劑盒;佛波酯(PM A)、離子霉素、均購自美國 BD Biosciences公司,人淋巴細胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。主要儀器:BD FACS Aria TM Cell Sorter購自美國 BD公司;低速臺式大容量離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠;CO2 INCUBATOR購自 Gold-SIM(U SA)INTERN ATIOANL GROUP CO.LTD.

1.4 Th17細胞檢測

所有受試者晨起空腹采靜脈血2mL,將采集的標本置于肝素鈉抗凝管中,用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)將血液1:1稀釋。應(yīng)用人淋巴細胞分離液獲取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBM C)后加 5倍以上 1640培養(yǎng)基 ,將其離心去清加 1mL含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基,100ng/mL離子霉素 ,1μg/mL PM A,1 μL蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑,混勻置入含有5%CO2、37℃的孵育箱中6h。結(jié)束后分為測定管及對照管,分別加入10μL抗人 CD4單抗,4℃暗處孵育30min,洗滌2次后對細胞固定透膜處理以便進行細胞因子染色。在測定管加抗人白細胞介素17A10μL,對照管加同型對照抗體,置于4℃避光30min,洗滌去清后加300μL PBS充分混勻,應(yīng)用流式細胞儀分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

慢性肺源性心臟病患者外周血中 Th17的表達:患者外周血加重期組 Th17/CD4+T細胞的比例明顯高于緩解期組及對照組 (P＜0.01),緩解期組與對照組之間無顯著差異(P ＞ 0.05)(表1)。

表1 CPHD加重期組與緩解期組、對照組Th17/CD4+T細胞的比較(±s)

表1 CPHD加重期組與緩解期組、對照組Th17/CD4+T細胞的比較(±s)

注:與加重期組比較*P＜0.01,與對照組比較△P＞ 0.05。

組別 n Th17/CD4+T細胞(%)加重期組 342.36±0.96緩解期組 340.89± 0.40△*對照組 201.03±0.48*

3 討論

CPHD是一種繼發(fā)性心臟病,該病易反復(fù),并發(fā)癥多 ,治療不理想,許多學(xué)者致力于與炎癥、免疫細胞功能失調(diào)等研究,例如對免疫球蛋白含量、自然殺傷細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞活性,T細胞亞群的百分率及 T細胞轉(zhuǎn)化率的測定[4]。 2003年,Aggarwal S.等發(fā)現(xiàn)人類存在 Th17細胞。大量研究證實該細胞主要分泌 IL-17A、IL-17F、IL-6、TNF-α、IL-21和 IL-22。IL-17A是一種致炎細胞因子[5],是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的啟動因子,可以刺激上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞產(chǎn)生 IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)和細胞黏附分子1(cellular adhesion molecule 1,CAM-1)等,也可以聚集并活化中性粒細胞,在炎癥及氣道重塑中發(fā)揮重要作用。隨著對 Th17細胞生物學(xué)特性、分化及調(diào)節(jié)機制的探討,證實了 Th17細胞分泌的 IL-17A在多種自身免疫病及炎性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、銀屑病以及哮喘、慢性阻塞性肺疾病患者的血清或組織中高表達[6,7]。也有學(xué)者應(yīng)用流式細胞技術(shù)觀察到慢性心力衰竭(CHF)患者外周血中 Th17細胞比例顯著增高,表明與 CHF發(fā)生發(fā)展及惡化密切相關(guān)[8]。 本研究中我們觀察到 CPHD患者急性加重期外周血 Th17/CD4+T細胞的比例明顯高于緩解期及對照組,表明 Th17細胞的變化與CPHD有一定關(guān)系,可能因為 Th17細胞的增加,直接和間接釋放大量效應(yīng)因子,引起機體免疫應(yīng)答,進而放大并促進炎癥反應(yīng) ,從而引起肺組織及心肌細胞損害。推測 Th17細胞的增加參與 CPHD的發(fā)生發(fā)展,我們可以通過對 Th17細胞的檢測來了解疾病的轉(zhuǎn)歸,為 CPHD預(yù)防和治療提供新靶點。

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