胡玉紅,向雪雯,張 燕,邢天容

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM T,簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥)是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜以外的部位[1]。該疾病雖為良性疾病卻具有侵襲、黏附、轉(zhuǎn)移等類似惡性腫瘤的“惡性”行為。內(nèi)異癥是臨床婦科常見疾病之一,近年來(lái)其發(fā)病率逐年增高?；颊咧饕憩F(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛、性交痛、不孕等,其一系列臨床癥狀嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。目前主要以手術(shù)和藥物治療為主,但效果局限,副作用明顯,且治療后易復(fù)發(fā)。本病迄今發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。腫瘤抑制基因 Kiss-1是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因。Kiss-1多肽能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性和侵襲性,并限制腫瘤細(xì)胞的遷移、蠕動(dòng)功能 ,表達(dá)于正常心臟、肝臟、肺、骨骼肌、腎組織和胰腺,而且在胎盤和腦觀察到了有較高的表達(dá)[2]。在子宮內(nèi)膜異位癥疾病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中,異位內(nèi)膜組織所表現(xiàn)出類似惡性腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處種植、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的特點(diǎn)通常被認(rèn)為與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化的基因改變有關(guān),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化方法檢測(cè) Kiss-1在三組子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況,并探究其在 EM T發(fā)病機(jī)制中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

1.1.1 異位內(nèi)膜組 (A組 ):選取2010— 01～ 2011— 04因子宮內(nèi)膜異位癥(均術(shù)后病理證實(shí))在本科室行開腹手術(shù)治療的病人30例為研究對(duì)象,分別取其異位內(nèi)膜組織 (其中包括巧克力囊腫19例、腹壁子宮內(nèi)膜異位癥11例)。

1.1.2 在位內(nèi)膜組 (B組):上述 30例同時(shí)行診刮術(shù)取在位內(nèi)膜組織進(jìn)行研究(術(shù)前已向患者告知,并征求患者同意),在位內(nèi)膜組中增生期 16例 ,分泌期 14例 (依照病理進(jìn)行分期)。

1.1.3 正常對(duì)照組(C組):同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的30例患者正常子宮內(nèi)膜且術(shù)后病理證實(shí)均為正常子宮內(nèi)膜組織,增生期15例,分泌期15例。

1.1.4 標(biāo)本的臨床特征:所有患者年齡23～ 48歲,平均35.7歲。所有患者術(shù)前均無(wú)放療、化療史,術(shù)前 6個(gè)月無(wú)激素治療史。

1.2 主要試劑

兔抗人 Kiss-1單克隆抗體,SP試劑盒,DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

所有標(biāo)本術(shù)中取下后用無(wú)菌生理鹽水充分沖洗后立即固定于 10%甲醛溶液中,梯度酒精脫水,常規(guī)石蠟包埋;連續(xù)切片,每張切片厚約3微米,切片常規(guī)脫蠟水洗。采用 SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,嚴(yán)格遵守說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。采用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,PBS液代替一抗作位陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

免疫組化細(xì)胞染色以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)內(nèi)膜組織中 KISS-1表達(dá)含量的不同采用電子計(jì)算機(jī)圖像分析儀進(jìn)行分析比對(duì),從而計(jì)算出 KISS-1在每張切片中的含量,并用平均灰度值來(lái)表示。免疫組化的強(qiáng)弱與灰度值成正比關(guān)系,即陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)越高活性越強(qiáng)則染色越深灰度值越大,反之則小。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 Excel2003將內(nèi)膜中 KISS-1表達(dá)的平均灰度值測(cè)定結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫(kù),采用 SPSS 17.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行均值比較及方差分析,兩組計(jì)量資料之間的比較采用 t檢驗(yàn),以P＜0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Kiss-1在三組子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

Kiss-1在 EM T患者異位內(nèi)膜(A組)、在位內(nèi)膜(B組)和正常對(duì)照組(C組)三組不同子宮內(nèi)膜組織中均表達(dá)。Kiss-1在 A、B兩組表達(dá)量均較 C組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。在 A組中的表達(dá)較 B組略低,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05)。 (見表1)

表1 Kiss-1在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá) ±s,n=30)

表1 Kiss-1在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá) ±s,n=30)

①異位內(nèi)膜組與在位內(nèi)膜組比較;②在位內(nèi)膜組與正常內(nèi)膜比較;③異位內(nèi)膜組與正常內(nèi)膜組較。

2.2 Kiss-1在三組內(nèi)膜中的表達(dá)與月經(jīng)周期的關(guān)系

Kiss-1在在位內(nèi)膜組及正常對(duì)照組的增生期與分泌期均見表達(dá),且增生期較分泌期略高,但兩期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05)。 (見表2)

表2 Kiss-1在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)與月經(jīng)周期的關(guān)系 ±s)

表2 Kiss-1在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)與月經(jīng)周期的關(guān)系 ±s)

①②分別為本組增生期與分泌期的比較

3 討論

Kiss-1是 Lee等[3]于 1996年應(yīng)用差異顯示和交減雜交技術(shù)首次在人黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。該基因定位于染色體長(zhǎng)臂1q 32～ q41區(qū),有四個(gè)外顯子構(gòu)成,能編碼一個(gè)大小為 145個(gè)氨基酸的親水 性蛋白,也稱 metastin(或 Kiss- 1肽 )[4]。當(dāng)metastin與受體結(jié)合后即可發(fā)揮腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的生物學(xué)效應(yīng),近而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡。對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制仍以 Sampson的經(jīng)血逆流學(xué)說(shuō)占主導(dǎo)地位,但迄今為止該學(xué)說(shuō)仍無(wú)法完美的解釋70%～90%的育齡期婦女存在經(jīng)血逆流,而罹患 EM T的育齡期婦女僅占10%～15%這一現(xiàn)象。異位的子宮內(nèi)膜能在宮腔外種植并繼續(xù)存活,與機(jī)體對(duì)其的抑制作用減低有關(guān)。并且隨著子宮內(nèi)膜異位癥疾病的發(fā)展推測(cè)其對(duì)抑制該疾病發(fā)展的Kiss-1基因表達(dá)拮抗作用增強(qiáng),保證異位內(nèi)膜在盆腔內(nèi)得以繼續(xù)存活并隨著月經(jīng)周期不斷生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示:Kiss-1在三組內(nèi)膜組織中均有表達(dá),異位內(nèi)膜組(A組 )和在位內(nèi)膜組(B組 )Kiss-1表達(dá)低于正常對(duì)照組(C組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);異位內(nèi)膜組(A組)中 Kiss-1表達(dá)略低于在位內(nèi)膜組(B組),兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。提示 EMT的發(fā)生可能與患者自身機(jī)體 Kiss-1基因表達(dá)受限有關(guān),異位內(nèi)膜在低抑制或無(wú)抑制的環(huán)境下增殖失控,進(jìn)而種植存活促進(jìn)內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。另外分析 Kiss-1在在位內(nèi)膜與正常內(nèi)膜組織中不同月經(jīng)周期(增生期和分泌期 )的表達(dá)情況,在在位內(nèi)膜組 (B組)中增生期與分泌期的表達(dá)均較低,增生期較分泌期略高,兩期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞ 0.05);而在正常對(duì)照組(C組)中增生期與分泌期表達(dá)均較高,增生期較分泌期略高,兩期比較差異仍無(wú)顯著性 (P＞ 0.05)。提示 Kiss-1的表達(dá)不受月經(jīng)周期的變化而變化。Kiss-1作為腫瘤抑制基因,其表達(dá)的 Kiss-1蛋白與GPR54受體結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)磷脂酶 C,進(jìn)一步產(chǎn)生第二信使 IP3和 DG,二者促進(jìn)鈣離子釋放和蛋白激酶 C的活化[5],體內(nèi)鈣離子濃度與腫瘤細(xì)胞的生存能力呈負(fù)相關(guān),即鈣離子濃度增加可抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡,蛋白激酶 C在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化方面發(fā)揮重要作用;同時(shí) Kiss-1表達(dá)產(chǎn)物能抑制細(xì)胞的趨化和侵襲。子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)抑制基因表達(dá)受限時(shí),異位的內(nèi)膜細(xì)胞逃避了凋亡調(diào)控,同時(shí)體內(nèi)微環(huán)境的改變也為異位內(nèi)膜的種植及侵襲提供了有利的溫床促進(jìn) EMT的形成。因此,我們可以在未來(lái)探尋治療 EM T的道路上將 Kiss-1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)視為新的靶點(diǎn),在分子水平上為 EM T的治療提供新的思路。

[1] 樂(lè)杰.婦產(chǎn)科學(xué) [M].第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008,325

[2] Takahashi C,Sheng Z,Horan TP,et al.Regulation of matrix metalloproteinase- 9and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(22):13221-13226

[3] Lee JH,Miele ME,Hicks DJ,et al.KISS- 1,a novel human malignant melanoma metastasis- suppressor gene[J].J Natl Cancer Inst,1996,88(23):1731-1737

[4] West A,Vojta PJ,Welch DR,et al.Chromosome localization and genomic structure of the KISS- 1 metastasis suppressor gene(KISS-1)[J].Genomics,1998,54(1):145-147

[5] Stafford L J,Xia C,MaW,et al.Identification and characterization of mouse metastasis-suppressor Kiss-1 and its G-proteincoupled receptor[J].Cancer Res,2002,62(19):5399-5404