薛 勇,顏 玉,朱德全,韓誠(chéng)武,劉 紅,魯兆寧

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;3.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)

草蓯蓉 ,拉丁名:Boschniakia rossica Fedt sch et Flerov;中文名:草蓯蓉拉丁科名:Orobanchaceae;中文科名:列當(dāng)科。保護(hù)級(jí)別:2;英文名:Boschniakia;別名:蓯蓉、不老草。多年生寄生草本植物,根莖瘤狀膨大,全株近無(wú)毛。莖直立,粗壯、圓柱形 ,肉質(zhì) ,紫褐色 ,高15～ 50cm,粗 1～ 2cm,葉鱗片狀 ,通常密集于莖基部,三角形或卵狀三角形。穗狀花序長(zhǎng)5～16cm,直徑 2～ 3cm;花多 數(shù),暗 紫色;苞片卵形,銳尖;花萼杯狀,有不整齊的 3～ 5齒裂;花冠唇形,花筒基部膨大成囊狀,上唇直立,細(xì)長(zhǎng),頭盔狀,近全緣或稍 2裂,下唇極短 ,明顯 3裂;二強(qiáng)雄蕊,伸出花冠外;心皮2,花主明顯 ,主頭2淺裂。蒴果近球形,二瓣裂;種子微小,多數(shù)。

通過(guò)檢測(cè)草蓯蓉甲醇提取物(BR)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞功能的影響,以篩選出能促進(jìn)大鼠肝癌細(xì)胞 GJIC功能的中藥活性成分;并進(jìn)一步定量檢測(cè)篩選出的活性成分對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞 GJIC功能的影響;在此基礎(chǔ)上再檢測(cè)該活性成分對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞 HSV-倒 GCV系統(tǒng)旁觀者效應(yīng)的影響,以了解該活性成分對(duì) GJIC功能是否有促進(jìn)作用;并進(jìn)一步檢測(cè)該活性成分對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞 Cx26和 Cx32表達(dá)的影響,以期探討該活性成分影響大鼠肝癌細(xì)胞 GJIC功能的機(jī)制,為臨床綜合治療腫瘤和拓展中藥的新用途提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

大鼠肝癌細(xì)胞株 CBRH7919購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 試劑與耗材

RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液為上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;0.25%含 EDTA胰酶的消化液為上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;胎牛血清為上海越研生物科技有限公司產(chǎn)品;新生牛血清為北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;青、鏈霉素溶液為北京賽馳生物科技有限公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑鹽(M TT)和二甲基亞砜(DMSO)均為上海拜力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿為德國(guó) Greiner bio-one公司產(chǎn)品;微孔濾膜為上海亞?wèn)|核級(jí)樹(shù)脂有限公司產(chǎn)品;塑料凍存管為上海拜力生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 藥物

1.3.1 草蓯蓉甲醇提取物(BR)。

1.3.2 草蓯蓉甲醇提取工藝流程。

草蓯蓉干品→ZN-08型中藥粉碎機(jī)切碎→,加甲醇浸泡過(guò)夜→用布氏濾斗過(guò)濾,共提取4次,合并→ R2003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮→YC-015微型實(shí)驗(yàn)室噴霧干燥機(jī)→甲醇提取物(BR)。

1.4 儀器

BNA-3210型 CO2培養(yǎng)箱 (日本 Espec);超凈工作臺(tái) (蘇州凈化設(shè)備廠);3169型倒置顯微鏡(重慶 COIC);Bio-Rad630酶標(biāo)儀 (日本 );細(xì)胞計(jì)數(shù)板 (上海求精生化試劑儀器有限公司);ALG1104型電子天平(日本島津);CDBER SCAN 510型 pH儀 (意大利 Hanna);N EX POW ER 1000型純水器(韓國(guó) Human Corp);YDS-30液氮器(四川省樂(lè)山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司公司);XY J-801型電動(dòng)離心機(jī)(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠);JB-1型攪拌器(上海雷磁儀器廠新徑分廠);LRH-150B生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠);BCD-215KANDZ電冰箱(青島海爾股份有限公司);Haier冰柜(青島海爾特種電冰柜有限公司);YX280B手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司);電熱恒溫干燥箱(長(zhǎng)沙醫(yī)療器械廠)。

2 方法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

迅速?gòu)囊旱拗腥〕龊笫蟾伟┘?xì)胞凍存液的凍存管,放入盛有39℃的溫水的保溫瓶中(考慮凍存管塑料管壁透熱性的不好,在37～ 38℃溫度上再適當(dāng)提高1～ 2℃ ),待凍存管內(nèi)細(xì)胞凍存液完全融化后,吸取凍存液至試管中,用 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋 5倍,混勻 ,以1000r/min離心5min,棄上清 ,再用 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕吹打成1×105/mL細(xì)胞懸液,然后將細(xì)胞懸液吸取至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)[1]。

2.2 細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、鋪板培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)

倒置顯微鏡觀察,待以上培養(yǎng)的大鼠肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)融合率達(dá)90%以上時(shí),吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液,用 PBS(0.01mol/L,pH 7.4)沖洗細(xì)胞 2～ 3次;滴加適量含0.25%EDTA的胰酶消化細(xì)胞,輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶,顯微鏡觀察,待細(xì)胞大部分變圓之時(shí),吸去胰酶,加入適量 RPM I-1640細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化;用吸管輕輕吹打貼壁的細(xì)胞數(shù)次,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞大部分脫落懸浮后,將細(xì)胞懸液吸取至試管中,以1500r/min離心 5min;棄上清,加入適量 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打混勻細(xì)胞;用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞,按每孔 4×103個(gè)細(xì)胞接種到 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入 RPMI-l640細(xì)胞培養(yǎng)液至總體積200μL,置于 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24h。剩余細(xì)胞按1:5左右的比例傳代培養(yǎng),供實(shí)驗(yàn)繼續(xù)使用[2]。

2.3 細(xì)胞分組及藥物處理

大鼠肝癌細(xì)胞隨機(jī)分為5個(gè)組:分別為1個(gè)對(duì)照組、4個(gè)實(shí)驗(yàn)組。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入草蓯蓉甲醇提取物,使藥物終濃度分別達(dá)到 0.25g/L、 0.5g/L、0.75g/L、 1.0g/L;對(duì)照組除加等體積的生理鹽水代替用藥外,其余步驟與用藥組完全相同。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各藥物組每孔加相應(yīng)濃度的藥物,各空白對(duì)照組(0 μLM組)加入與最高濃度藥物等體積的 DMSO,加藥后每孔體積不足200μL者,加入 RPM I-1640細(xì)胞培養(yǎng)液至總體積 200μL。置于 37℃ ,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48h。

2.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

藥物作用前后,用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)并攝片。加藥培養(yǎng)48h藥物作用前后,用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)并攝片。加藥培養(yǎng)48h草蓯蓉甲醇提取物 (BR)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞 GJIC影響的研究后,將 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出,吸棄每孔上清;每孔加入無(wú)血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液 90μL后再加入 MT T10μL,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 4h后;每孔吸棄上清 50μL,加入DMSO10μL,將 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于空氣浴震蕩器上震蕩10min;然后用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光值(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次[3]。

2.5 計(jì)算細(xì)胞存活率

細(xì)胞存活率(%)=T/D×100%(T:測(cè)定孔細(xì)胞的光密度平均值;D:對(duì)照孔細(xì)胞的光密度平均值)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 MTT比色法檢測(cè)草蓯蓉甲醇提取物(BR)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞增殖的影響

草蓯蓉甲醇提取物(BR)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)有抑制作用 ,0.25g/L、 0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L草蓯蓉甲醇提取物(BR)的24h體外細(xì)胞抑制率分別達(dá)到37.71%、50.28%、64.40%、98.58%;0.25～ 1.0g/L濃度范圍內(nèi)的草蓯蓉甲醇提取物(BR)在6～ 24h抑制大鼠肝癌細(xì)胞呈現(xiàn)出時(shí)效和量效關(guān)系 (表1)。

表1 草蓯蓉甲醇提取物(BR)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞的抑制率 ±s)

表1 草蓯蓉甲醇提取物(BR)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞的抑制率 ±s)

注:相同劑量不同時(shí)間同前一組比較,▲P(0.05)、▲▲P(0.01);相同時(shí)間不同劑量同前一組比較,*P(0.05)、**P(0.01)。

3.2 草蓯蓉甲醇提取物(BR)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

藥物作用前,倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)未見(jiàn)明顯差異,藥物作用24h后,鏡下觀察可見(jiàn),各組的細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)發(fā)生變化,倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察,每隔4h用倒置顯微鏡觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。倒置顯微鏡下,對(duì)照組大鼠肝癌細(xì)胞散在或聚集生長(zhǎng),有多層生長(zhǎng)現(xiàn)象,細(xì)胞大小不一,多形性,貼壁能力良好;實(shí)驗(yàn)組大鼠肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,呈單層生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)變圓,胞漿內(nèi)可見(jiàn)空泡樣改變,隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞貼壁能力逐漸減弱,較多細(xì)胞由貼壁轉(zhuǎn)為懸浮。

4 討論

惡性腫瘤是人類三大主要死亡原因之一,嚴(yán)重危害人類健康和生命。原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer)是人類最常見(jiàn)惡性腫瘤之一,全球每年約有100萬(wàn)人死于肝癌,其死亡率占消化系統(tǒng)惡性腫瘤中第三位。每年全世界有超過(guò)25萬(wàn)的新發(fā)病例 ,其中11萬(wàn) (44.7%)發(fā)生在中國(guó),且呈逐年上升趨勢(shì)。攻克肝癌已成為醫(yī)學(xué)界一個(gè)重大的研究課題。傳統(tǒng)的惡性腫瘤治療方法主要是手術(shù)切除、放療及化療。這些療法對(duì)早期腫瘤可獲得滿意的療效,但對(duì)于腫瘤的轉(zhuǎn)移、再發(fā)及晚期腫瘤則療效差 ,而且毒副作用較大。中藥是一個(gè)偉大的寶庫(kù),有待開(kāi)發(fā)和利用。從中藥中開(kāi)發(fā)出具有抗腫瘤作用的活性成分是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。如果能從中藥活性成分中篩選出具有直接抗腫瘤作用的藥物,并研究其作用機(jī)理,對(duì)于抗腫瘤新藥的研制開(kāi)發(fā)將具有重要的意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,草蓯蓉甲醇提取物(BR)對(duì)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性 ,只有在高濃度(0.75g/L和1.0g/L)時(shí)才對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞有明顯的抑制生長(zhǎng)和殺傷作用。

[1] 沈敬華,楊麗敏,張林娜.五種中藥提取物抗腫瘤作用的研究 [J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,27(4):300-302

[2] 劉靜.肉蓯蓉延緩衰老研究進(jìn)展 [J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2005,11(2):20

[3] 楚玉南,戴續(xù)紅,吳華新.草蓯蓉生物學(xué)特性初探 [J].中國(guó)林副特產(chǎn),2009,3:104

[4] 樸熙緒,黃紅果,樸東明.草蓯蓉乙醇提取物對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的治療作用 [J].世界華人消化雜志,2005,13(18):2206