郝桂彤,李紅艷,韓振爽
(1.天津懷仁制藥有限公司,天津 300385; 2.天津弗蘭德醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,天津 300457)
定風止痛片主要由三七、僵蠶、防風等藥組成,具有祛風化痰、行瘀散結、消腫定痛的功效,用于風痰瘀血阻絡引起的關節(jié)腫脹疼痛、筋脈拘攣、屈伸不利及破傷風的輔助治療[1]。該藥物中三七具有散瘀止血、消腫定痛的功效,其主要有效成分為皂苷類[2]。本文采用RP-HPLC法測定定風止痛片中人參皂苷Rg1含量,該方法結果準確,精密度高,重現(xiàn)性好。
Waters 510高效液相色譜儀(美國Waters公司),Waters 486紫外檢測器(美國Waters公司),KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。人參皂苷Rg1(中國藥品生物制品檢定所提供,批號:110703-200425),定風止痛片(天津懷仁制藥有限公司提供,批號091201、091202、091203),乙腈為色譜純,甲醇、乙醚和正丁醇均為分析純,水為去離子水。
2.1色譜條件 色譜柱:Packed C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相乙睛-0.05%磷酸溶液(21∶79),流速:1.5 ml/min,檢測波長:203 nm,進樣量:20 μl 。
2.2溶液制備
2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對照品適量,加甲醇制成每0.5 mg/ml溶液作為對照品溶液。
2.2.3供試品溶液的制備 取本品10片,研細,精密稱取細粉約4 g,置具塞三角瓶中,精密加入甲醇50 ml,稱定重量,超聲處理60 min,放冷,再稱定重量,加甲醇補足減失重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液25 ml,置蒸發(fā)皿內(nèi),水浴蒸干甲醇,殘渣加水30 ml使溶解,并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,用乙醚振搖提取2次,每次20 ml,棄去乙醚液,再用水飽和正丁醇振搖提取4次,每次30 ml,合并正丁醇提取液,用氨試液洗滌2次,每次20 ml,棄去氨試液,減壓回收正丁醇,殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
2.2.3陰性對照溶液的制備 按處方比例和工藝制備不含三七的陰性樣品,并按供試品溶液的制法制成陰性對照溶液,備用。
2.3專屬性考察 在上述色譜條件下,分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各20 μl,注入液相色譜儀。人參皂苷Rg1的保留時間為22.591 min,樣品色譜圖中,在與對照品溶液色譜圖相應保留時間處,有相同色譜峰,而陰性樣品在此處無干擾,色譜圖見圖1。
2.4線性關系考察 精密稱取人參皂苷Rg1對照品適量,配制成濃度為0.106、0.212、0.318、0.424、0.530和0.636 mg/ml的系列溶液。分別精密吸取20 μl注入液相色譜儀,以濃度(C)對峰面積(Y)進行線性回歸,得回歸方程為Y=7.423×105C-6.082×104(r=0.999 8)。結果表明人參皂苷Rg1在1.06~6.36 μg范圍內(nèi)線性關系良好。
1.人參皂苷Rg1
2.5精密度和重復性試驗 取同一對照品溶液,在上述色譜條件下,連續(xù)進樣6次,RSD為1.2%(n=6)。精密稱取同一批號供試品6份,分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下測定含量,RSD為0.67%,結果表明方法的重復性良好。
2.6溶液穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液,在室溫下放置不同時間后,分別于0、2、4、8、12、24 h時分別按上述色譜條件測定,結果表明,供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,峰面積的RSD為0.68%。
2.7加樣回收率試驗 取同一批號(091201)已知人參皂苷Rg1含量的樣品,研細,取約4 g,精密稱定,6份,置具塞三角瓶中,分別精密加入人參皂苷Rg1對照品溶液,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下測定含量,計算回收率,平均回收率為99.1%,RSD為0.56%(n=6),見表1。
表1 加樣回收試驗結果(n=6)
2.8樣品測定 取3批樣品按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。用外標法計算樣品中人參皂苷Rg1的含量,分別為0.868、0.882和0.863 mg/片。
3.1樣品處理方法選擇 皂苷類易溶于甲醇及水飽和的正丁醇中,但因本品為復方,含量測定時干擾因素較多,故需先對樣品進行純化處理。參照《國家中成藥標準匯編》中“復方三七膠囊”的含量測定項下有關“供試品溶液的制備方法”,先將本品細粉用甲醇超聲提取,然后取一定量甲醇液蒸干,用水溶解殘渣。因本品中防風、白芷和羌活均含有大量的揮發(fā)油及一些酯溶性成分,故先用乙醚萃取脫酯;然后用水飽和的正丁醇提取皂苷;用氨試液洗滌正丁醇層,以除去酸性雜質(zhì);最后蒸干正丁醇,殘渣加甲醇溶解并定容,溶液用微孔濾膜濾過即可。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn),此法提取效果理想,目標成分達到基線分離,且樣品平均回收率為99. 1%。
3.2超聲提取時間考察 分別取樣品細粉3份,依次超聲處理30、60和90 min,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并進行含量測定。結果表明:樣品超聲處理30 min,人參皂苷Rg1提取不完全;超聲處理60 min,人參皂苷Rg1的提取量即達100%,超聲處理90 min與60 min比,結果無顯著變化。故確定超聲時間為60 min。
3.3乙醚及氨試液提取次數(shù)的確定 水溶液在用乙醚脫酯及正丁醇層在用氨試液洗滌時,第1次顏色均較重,第二次均近乎為無色,故確定乙醚和氨試液的提取次數(shù)均為2次。
3.4正丁醇萃取次數(shù)的考察 經(jīng)考察,正丁醇第4次萃取液中,含人參皂苷Rg1為總含量的4.1%,第5次萃取液中,已基本檢測不到人參皂苷Rg1的色譜峰,由此可知,正丁醇提取4次,已基本將人參皂苷Rg1提取完全,故確定正丁醇提取次數(shù)為4次,以免造成浪費。
1 陰健,郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應用⑴.北京:學苑出版社,1993:33-37
2 江紀武,肖慶祥.植物藥有效成分手冊.北京:人民衛(wèi)生出版社,1986:503-509