郝桂彤，李紅艷，韓振爽

(1.天津懷仁制藥有限公司，天津 300385； 2.天津弗蘭德醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，天津 300457)

定風止痛片主要由三七、僵蠶、防風等藥組成，具有祛風化痰、行瘀散結、消腫定痛的功效，用于風痰瘀血阻絡引起的關節(jié)腫脹疼痛、筋脈拘攣、屈伸不利及破傷風的輔助治療[1]。該藥物中三七具有散瘀止血、消腫定痛的功效，其主要有效成分為皂苷類[2]。本文采用RP-HPLC法測定定風止痛片中人參皂苷Rg1含量，該方法結果準確，精密度高，重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

Waters 510高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters 486紫外檢測器(美國Waters公司)，KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。人參皂苷Rg1(中國藥品生物制品檢定所提供，批號：110703-200425)，定風止痛片(天津懷仁制藥有限公司提供，批號091201、091202、091203)，乙腈為色譜純，甲醇、乙醚和正丁醇均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Packed C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相乙睛-0.05%磷酸溶液(21∶79)，流速：1.5 ml/min，檢測波長：203 nm，進樣量：20 μl 。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對照品適量，加甲醇制成每0.5 mg/ml溶液作為對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 取本品10片，研細，精密稱取細粉約4 g，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 ml，置蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴蒸干甲醇，殘渣加水30 ml使溶解，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙醚振搖提取2次，每次20 ml，棄去乙醚液，再用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次30 ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次20 ml，棄去氨試液，減壓回收正丁醇，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液的制備 按處方比例和工藝制備不含三七的陰性樣品，并按供試品溶液的制法制成陰性對照溶液，備用。

2.3專屬性考察 在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各20 μl，注入液相色譜儀。人參皂苷Rg1的保留時間為22.591 min，樣品色譜圖中，在與對照品溶液色譜圖相應保留時間處，有相同色譜峰，而陰性樣品在此處無干擾，色譜圖見圖1。

2.4線性關系考察 精密稱取人參皂苷Rg1對照品適量，配制成濃度為0.106、0.212、0.318、0.424、0.530和0.636 mg/ml的系列溶液。分別精密吸取20 μl注入液相色譜儀，以濃度(C)對峰面積(Y)進行線性回歸，得回歸方程為Y=7.423×105C-6.082×104(r=0.999 8)。結果表明人參皂苷Rg1在1.06～6.36 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

1.人參皂苷Rg1

2.5精密度和重復性試驗 取同一對照品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進樣6次，RSD為1.2%(n=6)。精密稱取同一批號供試品6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定含量，RSD為0.67%，結果表明方法的重復性良好。

2.6溶液穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在室溫下放置不同時間后，分別于0、2、4、8、12、24 h時分別按上述色譜條件測定，結果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，峰面積的RSD為0.68%。

2.7加樣回收率試驗 取同一批號(091201)已知人參皂苷Rg1含量的樣品，研細，取約4 g，精密稱定，6份，置具塞三角瓶中，分別精密加入人參皂苷Rg1對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測定含量，計算回收率，平均回收率為99.1%，RSD為0.56%(n=6)，見表1。

表1 加樣回收試驗結果(n=6)

2.8樣品測定 取3批樣品按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。用外標法計算樣品中人參皂苷Rg1的含量，分別為0.868、0.882和0.863 mg/片。

3 討論

3.1樣品處理方法選擇 皂苷類易溶于甲醇及水飽和的正丁醇中，但因本品為復方，含量測定時干擾因素較多，故需先對樣品進行純化處理。參照《國家中成藥標準匯編》中“復方三七膠囊”的含量測定項下有關“供試品溶液的制備方法”，先將本品細粉用甲醇超聲提取，然后取一定量甲醇液蒸干，用水溶解殘渣。因本品中防風、白芷和羌活均含有大量的揮發(fā)油及一些酯溶性成分，故先用乙醚萃取脫酯；然后用水飽和的正丁醇提取皂苷；用氨試液洗滌正丁醇層，以除去酸性雜質(zhì)；最后蒸干正丁醇，殘渣加甲醇溶解并定容，溶液用微孔濾膜濾過即可。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，此法提取效果理想，目標成分達到基線分離，且樣品平均回收率為99. 1%。

3.2超聲提取時間考察 分別取樣品細粉3份，依次超聲處理30、60和90 min，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并進行含量測定。結果表明：樣品超聲處理30 min，人參皂苷Rg1提取不完全；超聲處理60 min，人參皂苷Rg1的提取量即達100%，超聲處理90 min與60 min比，結果無顯著變化。故確定超聲時間為60 min。

3.3乙醚及氨試液提取次數(shù)的確定 水溶液在用乙醚脫酯及正丁醇層在用氨試液洗滌時，第1次顏色均較重，第二次均近乎為無色，故確定乙醚和氨試液的提取次數(shù)均為2次。

3.4正丁醇萃取次數(shù)的考察 經(jīng)考察，正丁醇第4次萃取液中，含人參皂苷Rg1為總含量的4.1%，第5次萃取液中，已基本檢測不到人參皂苷Rg1的色譜峰，由此可知，正丁醇提取4次，已基本將人參皂苷Rg1提取完全，故確定正丁醇提取次數(shù)為4次，以免造成浪費。

1 陰健,郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應用⑴.北京：學苑出版社，1993:33-37

2 江紀武,肖慶祥.植物藥有效成分手冊.北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：503-509