運(yùn)乃茹，何志強(qiáng)

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150; 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，太原 030001)

阿奇霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，前期實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)阿奇霉素能夠抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成。氨溴索可以在銅綠假單胞菌形成的生物膜表面打孔，促進(jìn)環(huán)丙沙星透過(guò)生物膜，為研究阿奇霉素對(duì)于成熟的生物膜是否存在類似氨溴索的作用，建立了一種檢測(cè)CM129培養(yǎng)液中阿奇霉素與左氧氟沙星濃度的方法，用于檢測(cè)左氧氟沙星與阿奇霉素合用的透過(guò)量。

1 儀器與試藥品

1.1儀器 高效液相色譜儀：島津LC-10A，LC-10AD紫外檢測(cè)器，浙大N2000工作站，Waters反相C18柱(3.9 mm×150 mm)。pH計(jì)：上海雷磁PHSJ-4A型。分析天平：湘儀TG328B。磁力攪拌器：上海凱欣儀器廠85-2型。超聲儀：上海BRANSON廠SB3200，隔膜真空泵：天津市南開區(qū)騰達(dá)過(guò)濾器件廠GM-0.15型。渦旋振蕩器：BLENDER的ZH-2型。低速離心機(jī)：上海手術(shù)器械廠80-2型。

1.2試藥 阿奇霉素和左氧氟沙星對(duì)照品(純度>99%)購(gòu)自中國(guó)藥品和生物制品檢定所，西司他丁鈉對(duì)照品(純度97.8%)由山西省藥檢所提供。甲醇、乙腈、異丙醇、二氯甲烷為色譜純購(gòu)自天津四友化學(xué)試劑廠。磷酸二氫鉀及磷酸購(gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠，CM129培養(yǎng)基粉末購(gòu)自O(shè)xoid公司。

2 方法

2.1色譜條件 分析柱為Waters公司反相C18柱，流動(dòng)相為甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(29∶71，pH 2.53)，流速為1 ml/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為10 μl。左氧氟沙星保留時(shí)間為3.650 min，阿奇霉素保留時(shí)間為4.425 min，西司他丁鈉做為內(nèi)標(biāo)，保留時(shí)間為6.874 min。在空白培養(yǎng)液中加入以上三種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，處理后進(jìn)樣，色譜圖見圖1。

1.左氧氟沙星 2.阿奇霉素 3.西司他丁鈉

2.2樣品的制備與處理 培養(yǎng)銅綠假單胞菌，使之附著于微孔濾膜(0.22 μm)上形成生物膜，分別于生物膜剛形成及形成后的5 d(銀染觀察生物膜是否形成)向此裝置中加入左氧氟沙星與阿奇霉素，使之自由透過(guò)生物膜，透過(guò)生物膜后的培養(yǎng)液為待測(cè)樣品，每種樣本平行做3次。

取0.5 ml樣品至離心管內(nèi)，加入乙腈0.5 ml和異丙醇0.5 ml，渦旋振蕩5 min，放入低速離心機(jī)以4 000 r/min速度離心10 min，棄沉淀，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入1 ml二氯甲烷，渦旋振蕩5 min，放入低速離心機(jī)以4 000 r/min速度離心10 min，取出后靜置1 min，分層，取上清液，轉(zhuǎn)移至EP管中，取10 μl進(jìn)樣。試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[1-2]方法進(jìn)行改進(jìn)。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取阿奇霉素及左氧氟沙星對(duì)照品各32 mg , 用蒸餾水分別定容于10 ml 的量瓶中, 分別使之成3.2 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，取西司他丁鈉對(duì)照品10 mg，用蒸餾水定容至10 ml量瓶中，使之成為1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液。取五支試管，第一管加入1.2 ml CM 129培養(yǎng)液，加入0.4 ml的阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液及0.4 ml左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，其余四管分別加入1 ml的培養(yǎng)液。使用倍比稀釋法稀釋溶液，每管內(nèi)加入50 μg/ml西司他丁鈉1 ml。配制培養(yǎng)液中分別含左氧氟沙星、阿奇霉素濃度依次為160、80、40、20和10 μg/ml，西司他丁鈉為25 μg/ml。阿奇霉素測(cè)得吸收峰響應(yīng)值高度與西司他丁鈉測(cè)得測(cè)得吸收峰響應(yīng)值高度比值對(duì)阿奇霉素濃度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=0.048 2X-0.003(R2=1)；左氧氟沙星測(cè)得測(cè)得吸收峰響應(yīng)值高度與西司他丁鈉測(cè)得測(cè)得吸收峰響應(yīng)值高度比值對(duì)左氧氟沙星濃度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=0.071 5X+0.013(R2=1)。

2.4回收率試驗(yàn) 空白CM129培養(yǎng)液加入阿奇霉素與左氧氟沙星對(duì)照溶液, 各加入西司他丁鈉(1 mg/ml)做內(nèi)標(biāo)后，使之成20、40和160 μg/ml不同濃度,內(nèi)標(biāo)濃度25 μg/ml，按樣品處理后進(jìn)樣,標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得濃度與實(shí)際濃度相比得到回收率，重復(fù)3次，結(jié)果阿奇霉素和左氧氟沙星平均回收率分別為100.34%和99.83%，RSD分別為0.47%和1.08%。見表1。

表1 阿奇霉素和左氧氟沙星回收率測(cè)定結(jié)果

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 在空白CM 129培養(yǎng)液中加入阿奇霉素、左氧氟沙星及西司他丁鈉對(duì)照品配制高、中、低3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品CM 129培養(yǎng)液各5份, 按樣品處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)行測(cè)定, 計(jì)算方法的日內(nèi)及日間精密度，阿奇霉素RSD為1.34%，左氧氟沙星RSD為0.94%，結(jié)果見表2。

2.6樣品測(cè)定結(jié)果 樣本1為生物膜剛形成加入阿奇霉素與左氧氟沙星，樣本2為生物膜形成5 d后加入阿奇霉素與左氧氟沙星。取上述兩種樣本，依“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μl，分別檢測(cè)培養(yǎng)液中兩種藥物的濃度。結(jié)果見表3。從方法學(xué)驗(yàn)證及檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性來(lái)看，此類檢測(cè)方法適合于此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中樣本含量的測(cè)定。

表2 阿奇霉素和左氧氟沙星測(cè)量精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 樣本結(jié)果測(cè)定值 μg/ml

3 討論

此分析方法的建立可以用于檢測(cè)透過(guò)生物膜的左氧氟沙星及阿奇霉素的濃度。對(duì)于銅綠假單胞菌生物膜的形成過(guò)程，目前已知氨溴索與乙酰半胱氨酸能促進(jìn)左氧氟沙星(或環(huán)丙沙星)透過(guò)生物膜。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上來(lái)看，阿奇霉素在生物膜形成的初期，阿奇霉素與左氧氟沙星對(duì)于銅綠假單胞菌生物膜都有透過(guò)作用，但是當(dāng)生物膜形成之后，阿奇霉素對(duì)左氧氟沙星透過(guò)生物膜沒有影響，因此猜想阿奇霉素只有延緩生物膜形成的作用，對(duì)形成的生物膜并沒有類似于氨溴索的作用，在另外的電鏡實(shí)驗(yàn)中也證明了此觀點(diǎn)。而對(duì)于左氧氟沙星自身能透過(guò)形成的生物膜，很可能左氧氟沙星本身在銅綠假單胞菌生物膜形成中，與PQS信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)相似，生物膜中存在PQS信號(hào)分子的自由通道，因此喹諾酮類藥物自身對(duì)銅綠假單胞菌的生物膜就有透過(guò)作用。

1 潘強(qiáng)，張寧蘇，易大為，等.復(fù)方阿奇霉素葡萄糖注射液中阿奇霉素的HPLC測(cè)定.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36(2)：99

2 劉皈陽(yáng), 張梅, 王睿,等.大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對(duì)加替沙星透過(guò)細(xì)菌生物被膜的影響.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005,15(7)：725