沈亦紅

(浙江省醫(yī)療器械研究所，浙江 杭州 310009)

近年來，白內(nèi)障超聲乳化手術開展極為普遍，然而在成熟期白內(nèi)障和缺乏良好紅光反射的白內(nèi)障超聲乳化手術過程中，完成連續(xù)環(huán)形撕囊極為困難，處理不當易造成撕囊口放射狀撕裂及一系列嚴重并發(fā)癥，影響超聲乳化手術操作。為此，眼科臨床不斷地探索著各種方法，實踐證明，前囊膜染色劑的應用可以很大程度上降低此類手術的難度，減少術中并發(fā)癥的出現(xiàn)，提高手術成功率。目前藍域染色在白色白內(nèi)障超聲乳化術中應用研究比較多，但未發(fā)現(xiàn)對于其本身化學物質溶出物的試驗研究。從毒理學角度考慮，染色劑類醫(yī)用材料中的易溶出物質，如化學助劑殘留等是引起炎癥和組織免疫反應的主要原因。因此，為了降低對眼內(nèi)組織的毒性，保護白內(nèi)障患者在超聲乳化手術中的安全，對藍域染色劑中化學助劑殘留量的研究和控制非常重要。

目前，歐洲、日本、美國及中國均無染色劑中化學殘留助劑的標準檢驗方法。由于藍域染色劑組成復雜，分析時往往干擾測定，樣品前處理既要保證殘留助劑從樣品基體中分離出來，又要防止其他干擾成分過度析出造成干擾。本次試驗研究目的是預測溶出的水平，對從染色劑中可能溶出的殘留助劑進行詳細的分析，選擇適當?shù)臉悠非疤幚矸椒ê蛢x器檢測條件，使樣品中被檢測成分的分離效果更佳、靈敏度更高、受干擾的程度更小。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑。Agilent 6890N氣相色譜儀、7694E頂空進樣裝置、氫火焰離子化檢測器(FID)和色譜工作站 (Agilent公司，美國)，頂空瓶 (體積10mL);丙酮、異丙醇均為色譜純，購自美國 TEDIA“天地”試劑公司;氯化鈉(NaC1)為優(yōu)級純，購自德國默克公司，用前于450℃烘3～4h(去除吸附的有機物);Milli－Q超純水。

1.2 標準溶液的配制。取10 mL容量瓶兩個，加超純水數(shù)毫升，準確稱重。各滴加2滴丙酮和異丙醇，再稱重。增加的量即為丙酮或異丙醇的量，加超純水至刻度。計算含量后，取適量以上溶液用超純水配置成2種化學助劑的混合標準溶液。此標準溶液濃度為:丙酮 9.05mg/mL，異丙醇10.62 mg/mL。準確移取一定體積的混合標準中間工作液，根據(jù)檢測器的靈敏度及線性要求，用水稀釋成適用濃度的混合標準系列溶液，待測。

1.3 儀器條件。

1.3.1 Agilent 7694E/Headspace Sample 爐溫:80℃，進樣環(huán)溫度:90℃，傳輸管溫度:100℃;GC循環(huán)時間:5 min，樣本預熱時間:30 min，加壓時間:0.2 min，進樣時間:1 min。

1.3.2 Agilent 6890N/ALS Chemstation 進樣口:溫度200℃，分流比6:1;色譜柱:毛細管柱DB－WAX 30m* 0.32mm 膜 厚 0.5μm，流 速1.5mL/min;爐箱:溫度90℃，程序時間3min;檢測器:溫度200℃，H2流速30.0 mL/min，壓縮空氣流速350mL/min，氮氣補氣流速20mL/min。

1.4 標準曲線的繪制。取1.0 mL混合標準溶液，置10mL頂空瓶中，準確加入超純水1.0mL，同時加入0.76gNaCl，立即蓋上瓶蓋輕輕搖勻，在設定的頂空及色譜條件下進行分析。根據(jù)保留時間定性，以峰面積對濃度分別繪制丙酮和異丙醇的標準曲線。

1.5 樣品處理。稱量樣品1.0g(精確至1mg)，置10mL頂空瓶中，準確加入超純水1.0mL，同時加入0.76gNaCl，立即蓋上瓶蓋輕輕搖勻，在設定的頂空及色譜條件下進行分析。

2 結果與討論

2.1 定性分析。參考分析目標物 (荷蘭 Dutch Ophthalmic Research Center International B.V.公司生產(chǎn)的 Vision Blue0.5mL瓶裝染色劑，成分為0.1%臺盼藍磷酸鹽緩沖溶液)的性質和安捷倫氣相色譜柱應用說明。初選實驗條件:頂空平衡溫度100℃、平衡時間60min、進樣溫度105℃，傳輸線溫度120℃、進樣時間0.05min，毛細管柱DBWAX 30m*0.32mm膜厚0.5μm，初溫50℃保持2 min、10℃/min升溫至230℃保持5 min程序升溫，柱流速1.5mL/min，氣化室溫度200℃、分流比6:1，檢測器250℃。

樣品在5min前完全出峰，參考相關有機溶劑的氣相色譜圖，用標準有機溶劑定性出樣品中殘留的是丙酮和異丙醇兩種化學助劑。

2.2 定量分析。

2.2.1 頂空條件的選擇。

平衡溫度。依據(jù)測定物的沸點來選擇頂空平衡溫度。將20μg/mL丙酮、異丙醇對照液分別在60℃、70℃、80℃、100℃ 溫度下平衡30 min后進行測定，得到峰面積與平衡溫度間的關系 (見圖1)。試驗中發(fā)現(xiàn)，在相同的平衡時間條件下，隨著樣品平衡溫度的升高，進入氣相的丙酮和異丙醇的量增加，從而提高分析的靈敏度。但平衡溫度過高時頂空瓶的氣密性變差，影響方法的精密度，所以實際工作中一般在滿足靈敏度的前提下盡量選擇較低的平衡溫度。本研究中，設定平衡溫度為80℃。

圖1 平衡溫度對萃取效率的影響

平衡時間。平衡時間取決于被測組分分子從樣品基質到氣相的擴散速度，即與分子大小、介質黏度及溫度有關。設定平衡溫度為80℃，分別測定平衡時間為20min，30min，40min，50min，60min時上述對照液的峰面積，結果顯示，平衡時間少于30 min時，隨著時間的增加，峰面積明顯增加;當平衡時間超過30 min時，峰面積增幅趨緩，頂空的氣－液兩相已基本達到平衡。故本研究中頂空平衡時間選擇30 min。

基質效應的消除和減少的方法、頂空氣體中各組分的含量除與其本身的揮發(fā)性有關，還與樣品的基質有關，如丙酮和異丙醇易溶于水，與水存在較強的相互作用，因而富集效率低，較高的平衡溫度還會造成大量的水蒸氣。選擇加入0.76g氯化鈉具有提高溶液的離子強度、降低有機化合物在水中溶解度的作用，可以有效地消除樣品的基質效應，從而準確進行定量分析。

2.2.2 色譜條件的選擇。根據(jù)丙酮和異丙醇的結構性質及相關資料，通過實驗，我們選擇毛細管柱DB－WAX 30m*0.32mm膜厚0.5μm。在進樣口溫度200℃、FID檢測器溫度200℃的條件下選擇爐箱恒溫90℃，柱流速1.5mL/min，分流比6:1。丙酮2.3 min出峰，異丙醇2.5min出峰，各峰的分離度和理論塔板數(shù)見表1。

表1 對照品氣相色譜分析數(shù)據(jù)

2.3 方法學驗證。

2.3.1 校準曲線、線性范圍及檢出限。在分析確認的色譜條件下測定丙酮和異丙醇混合標準系列的峰面積，繪制標準曲線。以信噪比S/N=3對應檢出限，將5倍的檢出限作為方法定量下限見表2。

表2 各成分校準曲線回歸方程、線性范圍、檢出限及定量限

2.3.2 精密度及準確度。配制10μg/mL的丙酮和異丙醇標準溶液試樣進行6次測定。丙酮含量平均值為 9.314μg/mL，精密度 (RSD)為 3.507%，回收率 96.5%;異丙醇含量平均值為10.376μg/mL，精密度 (RSD)為2.926%，回收率98.8%，結果表明精密度準確度良好。

2.3.3 加標回收率試驗。取同一樣品3份，分別加入3種不同濃度標準溶液，測定丙酮和異丙醇濃度。結果顯示80%、100%、120%的樣品回收率，分別為丙酮為90～95%，異丙醇為89～95%，(n=6)。表明回收率情況良好。

2.4 樣品測定。分別對2個不同批號藍域染色劑中的丙酮、異丙醇殘留量按照外標法進行測定，測定結果見表3。

表3 眼科手術藍域染色劑化學助劑殘留量測定結果

3 結論

本實驗曾采用對樣品先進行蒸餾，收集餾出液直接進樣法。該樣品預處理回收率低，且長期直接進樣，樣品餾出液溶劑水會降低毛細管柱柱效。因此本實驗采用頂空進樣法，以水為溶劑，不僅可以延長柱子的壽命，而且空白對照液沒有雜質峰。同時，該方法樣品前處理操作簡便、方法的線性范圍寬、精密度好、準確度高、快速靈敏，適宜長期對染色劑進行質量控制。

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