李昕華

(胥桂華長(zhǎng)春市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 長(zhǎng)春 130000)

研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)其培養(yǎng)基(Astrocyte medium,AM)中的營(yíng)養(yǎng)因子發(fā)揮腦保護(hù)作用,從而減輕缺血、缺氧對(duì)神經(jīng)元造成的損害[1]。AM經(jīng)離心、過(guò)濾后可制成條件培養(yǎng)基(Astrocyte conditioned medium,ACM),用于細(xì)胞培養(yǎng),以判斷營(yíng)養(yǎng)因子的作用。本實(shí)驗(yàn)給予星形膠質(zhì)細(xì)胞不同處理后制備ACM,通過(guò)不同ACM對(duì)缺氧神經(jīng)元凋亡的影響,探討預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞GDNF腦保護(hù)作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生12hWistar大鼠:皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng);出生1～2d Wistar大鼠:星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 采用酶消化法結(jié)合機(jī)械分離法。

1.2.2 制備缺氧預(yù)處理細(xì)胞模型 將培養(yǎng)第6天的神經(jīng)元和第9天的星形膠質(zhì)細(xì)胞放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱孵育,取孵育30、90min作為預(yù)處理及缺氧時(shí)間,給予神經(jīng)元不同處理后分成3組:對(duì)照組

(control)、預(yù)處理+缺氧組(IPC+HY)、缺氧組(HY)。

1.2.3 制備ACM ACM1為正常AM,ACM2為預(yù)處理及再缺氧后GDNF高表達(dá)的AM,ACM2加入GDNF抗體中和后即為ACM3。

1.2.4 檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 分別用3種ACM孵育3組神經(jīng)元,培養(yǎng)24h后,采用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)神經(jīng)元凋亡。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元凋亡率[n=36,%,(±s)]

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元凋亡率[n=36,%,(±s)]

注:*P<0.05 compared with control group,#P<0.05 compared with HY group, △P<0.05 compared with ACM1 and ACM3 group

ACM1 ACM2 ACM3 control 4.28±0.27 5.31±0.58 5.63±0.49 IPC+HY (40.38±0.74)*# (26.34±0.52)*#△ (46.15±1.09)*#HY (52.13±0.64)* (41.62±0.67)* (55.34±1.11)*

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

不同ACM對(duì)正常對(duì)照組神經(jīng)元凋亡率無(wú)影響(P>0.05)。正常對(duì)照組早期神經(jīng)元凋亡率明顯低于另外2組(P<0.05),預(yù)處理+缺血組神經(jīng)元用ACM2孵育后凋亡率低于ACM1及ACM3組(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

在腦組織缺血過(guò)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮重要作用,通過(guò)分泌營(yíng)養(yǎng)因子和攝取離子等方式發(fā)揮腦保護(hù)機(jī)制[2],在缺血時(shí)如何減輕神經(jīng)元凋亡是腦保護(hù)的難題[3],本實(shí)驗(yàn)用厭氧培養(yǎng)箱孵育神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞,模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血預(yù)處理及再缺血過(guò)程,用不同ACM培養(yǎng)受損神經(jīng)元,建立體外星形膠質(zhì)細(xì)胞/神經(jīng)元相互作用體系,用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元凋亡,說(shuō)明缺氧預(yù)處理誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞GDNF表達(dá)增加,阻止神經(jīng)元早期凋亡的發(fā)生。

[1]Dienel GA, Hertz L. Astrocytic contributions to bioenergetics of cerebral ischemia[J].Glia.2005,50:362～388.

[2]Lee SH, Kim M, Yoon BW,et al.Targeted hsp70 disruption increases infarction volume after focal cerebral ischemia in mice[J].Stroke,2001,32(12):2905～1912.

[3]Le DA,Wu Y,Huang Z,et al.Caspase activation and neuroprotection in caspase-3 deficient mice after in vivo cerebral ischemia anti in vitro oxygen glucose deprivation[J].Proc Nail Acad Sci USA,2002,99:15188～15193.