趙振卿,盛小光,虞慧芳,王建升,張曉輝,顧宏輝
(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所,杭州,310021)
我國(guó)是花椰菜生產(chǎn)大國(guó),也是花椰菜種子生產(chǎn)大國(guó),培育、生產(chǎn)的花椰菜種子不僅在國(guó)內(nèi)廣泛種植,而且大量出口國(guó)外。種子純度是評(píng)價(jià)種子質(zhì)量的關(guān)鍵,也是種子產(chǎn)業(yè)的命脈。傳統(tǒng)的種子純度鑒定方法是以播種后植株的田間形態(tài)觀察為依據(jù),其周期長(zhǎng)、工作量大,且易受環(huán)境、季節(jié)因素影響,導(dǎo)致結(jié)果存在偏差。因此,開發(fā)快速、準(zhǔn)確的種子純度鑒定方法已成為種子科研單位和企業(yè)共同關(guān)注的課題。
SSR標(biāo)記技術(shù)可以通過檢測(cè)待鑒定樣品是否具有某一品種的基因特異片段來(lái)辨別其真?zhèn)?,從而?duì)種子純度進(jìn)行檢測(cè),具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、安全、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)。目前,SSR標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于水稻、棉花等作物的雜交種純度鑒定[1~4],在甘藍(lán)中也有應(yīng)用[5,6],而在花椰菜中尚未見報(bào)道。
浙801是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)選育的中熟花椰菜新品種,通過自交不親和系繁制的雜交一代商品種。本文通過篩選浙801特異的SSR片段,建立了鑒定浙801雜交種純度的SSR標(biāo)記技術(shù)體系。
供試材料為花椰菜品種浙801雜交種及其父本和母本,由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所提供。
SSR引物序列來(lái)自于http://www.brassica.info,由Invitrogen公司合成,SSR分析所用到的其他分子生物學(xué)試劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。
①播種與取樣 浙801雜交種及其父本和母本于2009年夏季播種,每份材料各種植20株,在成熟期經(jīng)田間形態(tài)鑒定后,采集較嫩葉片,于-70℃保存,用于SSR引物的篩選分析;2010年種植制種田生產(chǎn)的待檢測(cè)的浙801商品種200株,分單株編號(hào),于3~4葉期采集葉片,用于雜種純度的鑒定試驗(yàn)。
②總DNA的提取 所有材料的DNA均采用CTAB法小量提取,參考Doyle[7]的方法,略加修改。
③SSR分析 SSR的PCR擴(kuò)增總體積為10 μL,反應(yīng)體系如下:1×擴(kuò)增緩沖液,2 mmol/L的 MgCl2,0.2 mmol/L 的 dNTPs,0.5 U Taq酶,2.5 mmol/L 的引物,模板 DNA 50 ng,加 ddH2O 至終體積 10 μL,反應(yīng)在東勝龍熱循環(huán)擴(kuò)增儀上進(jìn)行。熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 2 min,1 個(gè)循環(huán);94℃變性 1 min,60℃復(fù)性 30 s,72℃延伸45 s,10個(gè)循環(huán),循環(huán) 1次復(fù)性溫度降低 0.5℃;94℃變性 1 min,55℃復(fù)性 30 s,72℃延伸 45 s,30個(gè)循環(huán);4℃保存。
SSR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,顯影采用簡(jiǎn)易銀染法[8]。
對(duì)2009年播種的浙801雜交種及其父本和母本分別于苗期、蓮座期、現(xiàn)球期和收獲期進(jìn)行了田間性狀的考察,通過株形、葉形、蠟粉、生育期以及花球形態(tài)等多方面的綜合評(píng)價(jià),確定所有供試材料均未出現(xiàn)異型株。
利用SSR引物直接對(duì)供試材料進(jìn)行了篩選,發(fā)現(xiàn)引物YP64可以將浙801雜交種與其父母本區(qū)分開來(lái)(圖1)。重復(fù)試驗(yàn)表明,此特異片段穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。
對(duì)2010年播種的200株浙801商品種以同樣方法進(jìn)行田間鑒定。苗期發(fā)現(xiàn)異型株2株,為147號(hào)和161號(hào)?,F(xiàn)球期發(fā)現(xiàn)異型株5株,為59號(hào)、72號(hào)、147號(hào)、155號(hào)和169號(hào)。收獲期的調(diào)查結(jié)果與現(xiàn)球期的一致。最終確定59號(hào)、72號(hào)、147號(hào)、155號(hào)和169號(hào)為異型株,該批雜交種的純度為97.5%。
在異型株中,59號(hào)、72號(hào)、155號(hào)和169號(hào)表現(xiàn)為母本表型,推測(cè)其是由母本自交所產(chǎn)生;147號(hào)表現(xiàn)為父本表型,可能是在制種田收獲雜種時(shí)誤收了少量父本。
利用SSR引物YP64對(duì)200株浙801商品種及其雙親的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,群體中共有195個(gè)單株擴(kuò)增出雜交種帶型(圖1),有4株擴(kuò)增出母本帶型(59號(hào)、72號(hào)、155號(hào)和169號(hào)),有1株擴(kuò)增出父本帶型(147號(hào)),雜種純度為97.5%,與2.2結(jié)果一致。
圖1 SSR引物YP64在浙801雙親、雜交種中擴(kuò)增的電泳檢測(cè)M:Marker;1:母本;2:浙 801 手工雜交種;3:父本;4~23:141 號(hào)~160號(hào)浙801商品種,其中10和18分別為異型株147號(hào)和155號(hào)。
長(zhǎng)期以來(lái),育種家們已積累了多種雜種純度鑒定的方法。如通過調(diào)查雜種F1代的育性來(lái)判斷三系配套生產(chǎn)的雜交種的真?zhèn)?,但這種方法只能識(shí)別出雄性不育系因受溫度、光照等因素影響產(chǎn)生微量花粉而自交產(chǎn)生的假雜種,其他來(lái)源的假雜種則無(wú)法識(shí)別。浙801雜交種是通過自交不親和系繁育的,若要鑒定雜交種的純度,只能以正常季節(jié)種植的F1群體中各單株的外形特征為依據(jù)進(jìn)行判斷,因?yàn)榉钦<竟?jié)種植的花椰菜外形特征變化很大。此外,外形鑒定法需結(jié)合各個(gè)時(shí)期的性狀來(lái)綜合判斷,耗時(shí)幾個(gè)月,而SSR標(biāo)記來(lái)檢測(cè)雜種純度則不受播種季節(jié)的限制,發(fā)芽后采集子葉抽提DNA即可,只需7~10 d就可完成。
本試驗(yàn)篩選出了共顯性SSR標(biāo)記YP64,用于檢測(cè)浙801商品種的純度,并與田間性狀調(diào)查的鑒定結(jié)果進(jìn)行了比較。最終結(jié)果表明,SSR標(biāo)記鑒定的結(jié)果與田間鑒定是一致的,而且結(jié)果更加客觀、可信。本試驗(yàn)中的SSR引物可以明確地檢測(cè)出母本自交、父本誤收因素造成的雜交種混雜,但不能鑒定出由異源花粉污染或機(jī)械混雜等造成的異型株。事實(shí)上,若采取嚴(yán)格的隔離措施,由后2種因素造成浙801商品種混雜的可能性幾乎為零。
下一步研究需要擴(kuò)大篩選的范圍,利用SSR標(biāo)記構(gòu)建花椰菜種質(zhì)資源和育種材料的DNA指紋圖譜,從而通過某1對(duì)或多對(duì)引物的組合區(qū)分任意品系或品種。指紋圖譜的構(gòu)建不僅將對(duì)雜交種純度鑒定提供技術(shù)支撐,而且在品種權(quán)保護(hù)等方面具有重要意義。
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