文 / 張 偉 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政 中國農業(yè)大學教育部功能乳品重點實驗室

人體正常的骨代謝過程是骨組織不斷進行改建活動的一個復雜過程，包括骨吸收和骨形成2 個方面。該過程的順序一般認為是：激活→骨吸收→骨形成。首先，參與骨吸收的破骨細胞大量被激活，破骨細胞將基質溶解，并把骨中鈣移出，形成骨吸收；隨后在骨吸收的表面形成骨細胞，成骨細胞合成非礦化的骨基質，同時把鈣運至鈣化區(qū)，最后，鈣、磷結晶逐漸沉積在骨基質中，骨基質鈣化，形成骨組織（圖1）。在骨代謝的過程中，每天都有一定量的骨組織被吸收，又有相當數量的骨組織合成，兩者保持著動態(tài)的平衡，維持著骨骼的健康（劉忠厚，1998）。

1 蛋白質攝入對骨骼健康的影響

圖1 骨質更新的過程

蛋白質作為骨骼有機基質的原料，對骨骼健康至關重要。蛋白質攝入量低不僅危及峰值骨量的獲得，也危及中老年期間骨量的維持。蛋白質營養(yǎng)不良可增加骨質疏松性骨折的風險。營養(yǎng)不良會使肌肉萎縮，運動協(xié)調、反應時間和肌肉強度等保護機制受損，從而增加跌倒風險。營養(yǎng)低下者軟組織的保護作用也會減弱，不能有效地襯墊骨骼，因而增加了對骨質疏松性骨骼的機械負荷（Conigrave et al，2008）。相反，高蛋白質攝入量的人群骨量較高，絕經前期女性更為明顯。老年就醫(yī)患者中，低蛋白質攝入量者其股骨頸骨密度（Bone Mineral Density，BMD）低且身體機能受損。高蛋白質攝入量和BMD值較高的患者身體機能明顯改善。日本和美國女性的研究發(fā)現，橈骨BMD和蛋白質攝入量間存在正相關，高蛋白質攝入能降低髖骨發(fā)生骨折的危險性，高蛋白質攝入的研究對象發(fā)生髖骨骨折的危險性僅為低蛋白質攝入者的31%；同時這種蛋白質與骨量的正相關在鈣和維生素D攝入充分的條件下更顯著（柳啟沛，2009）。可見攝入適量的蛋白質是維持骨骼完整性所必需的。

2 蛋白質攝入影響骨骼健康的機理

蛋白質攝入對骨骼健康有著重要的意義，特別是對處于生長期的兒童和青少年，攝入充足均衡的蛋白質能夠促進兒童骨骼生長，增加骨峰值及骨密度，減緩成年后骨量流失。對于老年人，其消化功能減退，常常導致蛋白質攝入不足。在老年性髖部骨折病例中，有很大一部分都存在蛋白質攝入不足的問題（Rizzoli and Bonjour，2004）。蛋白質對于人體骨骼的積極作用已經得到了廣泛的認可，但對其機理仍不明確。之前的研究一直認為，蛋白質促進骨骼健康是由于蛋白質的營養(yǎng)功能，即為機體提供充足的氨基酸來源。但近幾年的深入研究發(fā)現，蛋白質對于骨骼健康的影響涉及更為復雜的生命活動，蛋白質的攝入可以影響體內的氨基酸水平，并激活體內鈣離子敏感受體，從而促進鈣的吸收和分泌，調節(jié)體內鈣平衡。這一過程通常還伴隨著體內相關激素水平的變化，提高胰島素樣生長因子-1的含量，從而促進機體鈣、磷的吸收和礦化過程，同時抑制甲狀旁腺激素的水平（Conigrave et al，2008）。

食物中蛋白質種類十分豐富，很多蛋白質含有非蛋白質成分，如表面糖基、金屬離子等，這些蛋白質的功能基團也對骨骼健康有影響。有研究表明，含有硫酸鹽基團的蛋白質或多糖等大分子在以碳酸鹽為基礎的生物礦化過程中扮演著重要角色?；谔妓徕}的生物礦化過程存在著一些共同特點。首先是一些非水溶性物質（如幾丁質、Ⅴ型膠原、細胞膜磷脂質等）形成局部微小密閉空間，之后在密閉空間內晶體成核、生長。硫酸角質素是碳酸鈣礦化過程中形成成核位點的關鍵大分子，硫酸角質素可以促進礦化初期成核位點微小顆粒的生成。研究顯示，多種蛋白質和多糖均參與生物礦化的調節(jié)與控制，其中硫酸鹽基團與某些具有化學活性基團的相互作用至關重要（Arias and Fernandez，2008）。

3 乳蛋白與骨骼健康

3.1 乳鐵蛋白

乳鐵蛋白（LF）是一種廣泛分布于哺乳動物的乳汁及各種分泌液中的天然鐵結合性糖蛋白。在LF的N端和C端兩葉結構中分別含有1 個鐵結合位點，每一葉都能高親和性地、可逆地與鐵結合，當Fe3+ 從LF脫離后會引起LF構象發(fā)生變化（Baker and Baker，2004）。同時在牛源LF表面第233、368、476和545位的天冬氨酸殘基上分別結合有1 個糖基鏈（Moore et al，1997）。作為乳中一種天然活性蛋白質，研究人員已經對乳鐵蛋白的功能特性開展了大量研究。近幾年的研究結果表明，乳鐵蛋白還具有促進成骨細胞增殖和促進體內骨合成的活性，展現出了治療骨質疏松癥的潛力（Cornish et al，2010）。

體外試驗方面，2002年Lorget等首次報道了LF具有潛在的成骨活性。其研究結果表明，LF可以抑制破骨細胞表型標志物——降鈣素受體mRNA的表達量，同時抑制體外培養(yǎng)破骨細胞的增殖和骨吸收的發(fā)生（Lorget et al，2002）。LF對成骨細胞的作用在2 年后得到了驗證。2004年Cornish等人的研究表明，正常生理濃度的LF（1～100 μg/mL）可以明顯促進成骨細胞的增殖和分化，同時對成骨細胞凋亡的抑制率可高達50%～70%。令人意外的是，LF的成骨活性比眾多已知的成骨細胞生長因子，如上皮生長因子、轉化生長因子β、甲狀旁腺激素、胰島素等高1～2 倍（Cornish et al，2004）。

體內試驗方面，2009年Guo等人報道了口服乳鐵蛋白對大鼠絕經后骨質疏松癥具有改善作用，并對LF的體內成骨活性進行了評價。結果顯示：口服LF可以顯著提高大鼠股骨和椎骨的骨密度及最大抗壓力；顯微CT分析表明，LF組大鼠骨小梁間連接性明顯優(yōu)于對照組，骨小梁缺損明顯減少；同時，LF可以顯著提高大鼠血清降鈣素、骨鈣素的合成，降低血清堿性磷酸酶和尿脫氧吡啶啉含量，提示LF可以提高骨合成，同時減弱骨吸收（Guo et al，2009）。同年2 個月后，法國Blais研究小組報道了與本研究相似的結果，口服的LF可以進入小鼠循環(huán)系統(tǒng)，并提高小鼠骨密度和脛骨抗壓能力（Blais et al，2009）。另外，Cornish等將LF局部注射于小鼠顱骨表面（4 mg/天，連續(xù)5 天），發(fā)現注射部位的骨骼增長是對照部位的4 倍，組織形態(tài)評估還顯示礦物疊積率和骨形成率明顯增加，表明LF在體內可以促進骨骼生長（Cornish et al，2004）。

乳鐵蛋白的成骨活性同樣在人群試驗中得以證實。Bharadwaj等開展了乳鐵蛋白對絕經后婦女骨代謝標志物的影響研究，結果表明，口服LF可以抑制破骨細胞的骨吸收活性；同時LF組受試者骨合成代謝標志物：骨特異性堿性磷酸酶、骨鈣蛋白的含量分別增加了45% 和16%，證明LF可以促進人體內成骨細胞的活性（Bharadwaj et al，2009）。

Grey等人研究發(fā)現，在成骨細胞表面存在著乳鐵蛋白的結合受體之一——低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRP1）。LRP1一方面可以介導成骨細胞內吞LF，從而使LF進入細胞內部；另一方面還可以通過LRP1激活成骨細胞MAPK信號通路ERK旁路中的p42/p44分裂原，以激活蛋白激酶（p42/p44MAPK，也稱ERK1/2）的磷酸化，從而促進成骨細胞的增殖。但進一步的研究表明，LF在被阻斷內吞進入成骨細胞的情況下其成骨活性并不減弱，說明LF進入細胞并不是其促進成骨細胞增殖的作用方式，LF是通過調控成骨細胞的胞內信號通路來發(fā)揮作用的（Grey et al，2004）。

以上體內、體外研究結果表明，LF展現出了很好的成骨活性，對骨骼代謝具有積極作用，但其作用機理仍不明確。

3.2 酪蛋白磷酸肽

酪蛋白磷酸肽（Casein phospopeptides，簡稱CPPs）是以牛奶酪蛋白為原料，經單一酶或復合酶水解，再對水解產物進行分離純化而得到的含有磷酸絲氨酸簇的生物活性肽。

CPPs的分子結構有α和β 2 種。其中α-CPPs由αsl-酪蛋白酶解得到，含有7 個具有高電荷的Ser-p部分。如果用胰蛋白酶水解αs1-酪蛋白，可切斷其第42～43氨基酸之間和第79～80氨基酸之間的肽鍵，制得的氨基酸殘基數為37的多肽，分子量為4600。β-CPPs由β-酪蛋白酶解得到。β-CPPs從其N末端開始，到第25 個氨基酸殘基為止，含有4 個具有高電荷的Ser-p部分。如果用胰酶水解β-酪蛋白，可制得氨基酸殘基數為25的多肽，分子量為3100。2 種CPPs均含有相同的核心部位，即成串的磷酸絲氨酸和谷氨酸簇，其基本結構可表示為：-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-。它們即為CPPs的功能基團（吳思方等，1998）。

鈣是人體內含量最豐富的元素之一，對人體健康起著十分重要的作用，然而它也是最易缺乏的礦物質元素之一。據報道，我國老年人因缺鈣引起的骨質疏松發(fā)病率高達30%～50%，兒童因缺鈣引起的佝僂病高達40%，妊娠婦女缺鈣比例也非常高，嚴重威脅著人們的健康（范江平，2004）。因此合理的補鈣，是人們普遍的需求。長期研究表明，鈣缺乏的主要原因并不是日常鈣攝入量不足，而是吸收率低下（陳慶森等，1999）。如何提高鈣的吸收率，是人們一直以來在進行的研究。20世紀50年代初，Mellander等首次用胃蛋白酶和胰酶作用于酪蛋白得到了CPPs。他們發(fā)現，在生理pH值下，CPPs的鈣鹽具有非常好的溶解性，且患有佝僂病的小孩服用酪蛋白的胰酶消化液可以強化骨骼的鈣化（Mellander，1950）。1958年，Reeves等的動物體外試驗表明，CPPs可以在中性和偏堿性條件下阻止鈣的沉淀，從而促進鈣在小腸中的吸收（Reeves et al，1958）。Lee等和Sato也先后證明CPPs具有促進鈣質吸收的功能（Lee et al，1986；Sato et al，1986）。Sato用含有CPPs的食物喂養(yǎng)大鼠，并在食物中加入同位素標記的鈣，發(fā)現其大腿骨骼中的標記鈣明顯高于對照。Heancy等也利用放射線標記的鈣讓停經的婦女服用，以研究CPPs是否具有促進鈣吸收的功效。結果顯示，CPPs對鈣的吸收確實有正面的影響（Glimcher，1980）。國內張亞非等也通過動物試驗證明，無論是低鈣飼料還是基礎飼料，添加一定量的CPPs后，可顯著增加斷乳大鼠對鈣的吸收率和儲留率（張亞飛等，1994）。

在對由體外酶水解制得的CPPs的功能性質進行研究的同時，許多研究者從飼喂酪蛋白的動物腸道內分離CPPs，并對其一級結構和功能性質進行分析研究。Naito等最早用含有酪蛋白的配合飼料飼喂大鼠，間隔一定時間后從腸內容物中分離到CPPs。將此來源的CPPs和用胰蛋白酶水解得到的CPPs作比較后發(fā)現，在37 ℃下從體內分離的CPPs比在體外水解得到的CPPs阻止磷酸鈣沉淀的作用更明顯（Naito et al，1972）。Lee等用結扎腸環(huán)法進行了活體鈣吸收試驗，結果表明，攝入酪蛋白的大鼠比攝入其它蛋白質的大鼠吸收了更多的鈣，并推算出腸內數微摩爾的CPPs即可阻止40～100倍的鈣沉淀（Lee et al，1983）。Meisel等用酪蛋白飼喂小豬后，從小豬的小腸內分離得到結構為αs1（61-74）的CPP（Meisel et al，1983）。Hirayama等從飼喂CPPs的大鼠小腸內分離得到結構為αs1（61-67）和β（7-20）的CPPs。可見，與體外水解得到的CPPs相比，體內分離得到的CPPs肽鏈較短，但二者含有相同的核心部分，且具有相似的功能性質。動物攝入含有酪蛋白的食物后，在腸道蛋白酶作用下，可生成具有促進鈣吸收功能的CPPs，這被認為是乳及乳制品中的鈣具有較高的生物可利用性的原因之一（Hirayama et al，1992）。

眾多研究已經表明，酪蛋白磷酸肽在腸道中性或弱堿性環(huán)境下可以有效阻止磷酸鈣沉淀產生，使腸內溶解鈣的量保持在高水平，從而促進鈣的吸收和利用（陳慶森等，1999）。因此酪蛋白磷酸肽具有很強的促鈣吸收活性。這將有望解決長期存在的鈣攝取量不足的問題，有效地預防骨質疏松癥和兒童缺鈣癥。

4 結論與展望

飲食中乳蛋白的攝入在人體骨骼發(fā)育和更新過程中扮演著十分重要的角色，特別是對處于骨量積累期的兒童和青少年。攝入充足全面的蛋白質可以促進兒童骨骼生長，增加骨峰值及骨密度，減緩成年后的骨量流失。乳蛋白促進人體骨骼生長代謝，一方面是通過其營養(yǎng)功能，可以供給機體骨合成代謝所必須的氨基酸和能量，但更為重要的是影響體內礦物質的吸收代謝，以及與礦化過程相關的多種激素水平，促進骨骼的合成代謝。在細胞及分子水平上，深入研究乳蛋白攝入對骨骼健康的影響機理，是今后主要的研究方向。■

[基金支持：“十一五”國家科技支撐計劃（2009BADB9B06）]

[1] 陳慶森，龐廣昌. 生物活性肽─酪蛋白磷酸肽（CPP）的研究、應用及展望. 食品科學，1999（6）：25-30.

[2] 范江平. 酪蛋白磷酸肽（CPP）在食品業(yè)的應用. 中國食物與營養(yǎng)，2004（3）：22-23.

[3] 馮鳳琴，王博誠，倪莉，等. 酪蛋白磷酸肽分離純化及分子結構的鑒定. 無錫輕工大學學報，1999，18（4）：33-37.

[4] 蔣國昌，黃明智. 水解膠原蛋白與中老年人骨骼健康. 中國老年保健醫(yī)學，2007， 5（1）：18-20.

[5] 劉忠厚. 骨質疏松學. 北京：科學出版社，1998.

[6] 柳啟沛. 營養(yǎng)因素與骨骼健康. 營養(yǎng)健康新觀察，2009（2）：3-4.

[7] 吳思方，湯亞杰. 酪蛋白磷酸肽的研究進展. 食品科學，1998（5）：3-6.

[8] 張亞非，周羽并，吳鳳蘭，等. 酪蛋白磷酸肽（CPP）對大鼠鈣吸收利用的影響. 營養(yǎng)學報，1994，16（1）：73-77.

[9] Arias L J，Fernandez M S. Polysaccharidesand proteoglycans in calcium carbonate-based biomineralization. Chem Rev，2008（108）：4475–4482.

[10] Bharadwaj S，Naidu A，Betageri GT，et al. Milk ribonuclease-enriched lactoferrin induces positive effects on bone turnover markers in postmenopausal women. Osteoporosis Int，2009（20）：1603-1611.

[11] Blais A，Malet A，Mikogami T，et al.Oral bovine lactoferrin improves bone status of ovariectomized mice. Endocrinol Metab，2009（296）E1281-E1288.

[12] Conigrave AD，Brown EM，Rizzoli R.Dietary protein and bone health：roles of amino acid–sensing receptors in the control of calcium metabolism and bone homeostasis. Annu Rev Nutr，2008（28）：131–55.

[13] Cornish J，Callon KE，Naot D，et al.Lactoferrin is a potent regulator of bone cell activity and increases bone formation in vivo.Endocrinology，2004（145）：4366-4374.

[14] Cornish J，Naot D，Reid I. Molecular mechanisms involved in the mitogenic effect of lactoferrin in osteoblasts. Bone Suppl.1，2010（46）：S47-S47.

[15] Glimcher M J. Composition，srtucture and organization of bone and other maneralized tissues and the mechanism of calcification. In：Greep R O，Astwood EB ，eds. Handbook of physiology-endocirnoloyg. Vol.VII. Washington DC： Ameircan Institute of physioloyg，1980.125-135.

[16] Grey A，Banovic T，Zhu Q，et al. The lowdensity lipoprotein receptor-related protein 1 is a mitogenic receptor for lactoferrin in osteoblastic cells. Mol Endocrinol， 2004（18）：2268-2278.

[17] Grey A，Zhu Q，Watson M，et al.Lactoferrin potently inhibits osteoblast apoptosis，via an LRP-independent pathway.Mol Cell Endocrinol，2006（251）：96-102.

[18] Guo H Y，Jiang L，Salam A I，et al. Orally administered lactoferrin preserves bone mass and microarchitecture in ovariectomized rats. J Nutr，2009（139）：958-964.

[19] Hirayama M，Toyota K，Yamaguchi G，et al. HPLC analysis of commercial casein phosphopeptides（CPP）. Biosci Biotech Biochem，1992，56（7）：1126-1127.

[20] Lambert L A，Perri H，Halbrooks P J，et al.Evolution of the transferrin family：conservation of residues associated with iron and anion binding. Comp Biochem Phys Part B，2005（142）：129–141.

[21] Lee Y S，Noguchi T，Natio H. Intestinal absorption of calcium in rats given diets containing caseinor amino acid mixtuer：the role of casein phosphopeptides. Bir J Nutr， 1983（49）：67-76.

[22] LeeYS，Toguchi，Natio H.Phosphopepitdes and soluble calcium in the small intestine of rats given a casein diet. Bri J Nutr，1986，43（3）：457-467.

[23] Lorget F，Clough J，Oliveira M，et al. Lactoferrin reduces in vitro osteoclast differentiation and resorbing activity. Biochem Bioph Res Co，2002（296）：261-266.

[24] Meisel H，Fiister H. Chemical characterization of bioactive peptides from in vivo digests of casein. Dairy Res，1983（56）：343-349.

[25] Mellander O. The physiological importance of the casein phosphopeptides calcium salts.II.Peroral calcium dosage in infants. Some aspects of the pathogenesis of rickets. Actasoc Med Clps，1950（55）：247-255.

[26] Naito H，AandImzmum T. In vivo formation of phosphopeptide with calcium-binding property in the small intestinal tract of the rat fed in casein.Agri Biol Chem，1972，36（3）:409-415.

[27] Rizzoli R，Bonjour J P. Dietary protein and bone health. J Bone Miner Res， 2004，4（19）：527-531.

[28] Reeves R E，Latour N G. Calcium phosphoarte sequestering form casein.Scienec， 1958（128）：472-476.

[29] Sato R，Noguchi T，Natio H. Casein phosphopeptides（CPP） enhances calcium absorption for the ligated segment of rats small intestine. Nutr Sci Vitanirnol，1986，（32）：67-76.

[30] Theil C E.Iron：ferritin，and nutrition. Annu Rev Nutr，2004（24）：327-343.

[31] Ward P P，Mendoza-Meneses M，Cunningham G A，et al. Iron status in mice carrying a targeted disruption of lactoferrin. Mol Cell Biol，2003，23（1）：178-185.

[32] Ward P P，Paz E，Conneely O M.Multifunctional roles of lactoferrin：a critical overview.Cell Mol Life Sci，2005（62）：2540-2548.