楊春燕 曹成珠 汪曉筠 朱艷媚 嚴云飛

青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001

肝病在藏區(qū)中被稱作“赤巴病”，在藏醫(yī)藥的經(jīng)典著作中赤巴病被列為三大疾病之首。由飲食、生活習慣、氣候條件、經(jīng)濟落后、性格影響和遺傳導(dǎo)致。七味紅花殊勝散治療肝病的主要機制是，活血化瘀改善肝臟微循環(huán)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用健康SD大鼠，由青海省實驗動物中心提供。大鼠抗Caspase－3多克隆抗體由SantaCruz公司生產(chǎn);NO測試盒購于北京中山公司。

1.2 分組與取材方法

雄性大鼠40只隨機分成4組。①正常對照組10只;②缺血組10只;③缺血再灌組10只;④七味紅花殊勝散組10只。全麻下消除肝臟側(cè)支循環(huán)，用Pringle法使肝缺血［1］，建立全肝缺血再灌注模型。對照組麻醉后僅行開腹手術(shù)，而不阻斷入肝血流［2］。

1.3 Caspase－3免疫組織化學染色

采血后快速取出肝臟固定48h，①切片脫蠟至水，在PBS中搖洗;②3%甲醇－過氧化氫室溫下孵育，蒸餾水清洗，PBS搖洗;③10%血清工作液封閉抗原，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育;④加入抗Caspase－3抗體，4℃冰箱過夜;⑤PBS搖洗，加入生物素化二抗IgG，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育;⑥PBS中搖洗，加入辣根酶標記液，37℃恒溫水浴鍋濕盒內(nèi)孵育;⑦PBS中搖洗，DAB顯色，自來水充分沖洗，終止顯色，中性樹膠封片。每例動物隨機選取5張切片于光學顯微鏡下進行觀察。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 各組NO檢測 (結(jié)果見表1)。

表1 各組大鼠血清NO含量的變化()

表1 各組大鼠血清NO含量的變化()

注:*與再灌注組相比，P＜0.01。

組別 n NO(μmol/L)正常對照組 10 19.82±0.71*缺血組 10 17.43±1.28*再灌組 10 12.36±0.12七味紅花殊勝散組 10 16.51±1.49*

大鼠血清NO含量再灌組與正常組相比 (P＜0.05)，與七味紅花殊勝散組相比 (P＜0.05)。

2.2 各組肝細胞凋亡率及caspase－3陽性細胞計數(shù) (s)(結(jié)果見表2)。

表2 各組肝細胞凋亡率及caspase－3陽性細胞計數(shù)

表2 各組肝細胞凋亡率及caspase－3陽性細胞計數(shù)

注:*與再灌注組相比，P＜0.01。

組別 n 細胞凋亡率% caspase－3(number/mm2)正常對照組 10 3.58±1.52 6.02±1.20*缺血組 10 7.86±2.13 9.43±1.68*再灌組 10 6.15±1.98 8.36±0.96七味紅花殊勝散組 10 4.51±2.09 6.21±1.49*

肝細胞凋亡率及caspase－3陽性細胞計數(shù)再灌組與正常組相比 (P＜0.05)，與七味紅花殊勝散組相比 (P＜0.05)。

3 討論

缺血再灌注肝損傷 (HIRI)是肝臟和創(chuàng)傷外科疾病中常見的病理過程，也是導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭或肝移植早期無功能的主要原因之一。缺血再灌注損傷過程中肝臟及肝外臟器會出現(xiàn)一系列代謝、結(jié)構(gòu)和功能的損傷，有時甚至引起肝功能衰竭及多器官功能衰竭。肝臟缺血再灌注損傷機制目前尚未完全闡明。近年來的研究表明，枯否氏細胞和中性粒細胞是引起肝缺血再灌注損傷的關(guān)鍵細胞，它們激活時釋放出的外源性活性氧可致肝竇內(nèi)皮細胞和肝實質(zhì)細胞損傷，并增加黏附分子表達，致使血小板和中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附，引起了肝臟微循環(huán)的障礙。這將直接影響到疾病的預(yù)后、手術(shù)成功率和病人的存活率。因此，對于肝臟缺血再灌注作用機制的研究，具有重要的臨床意義［3－4］。Caspase－3被認為是 Caspase家族介導(dǎo)細胞凋亡的最終執(zhí)行者，本實驗結(jié)果表明:肝缺血再灌注損傷時Caspase－3基因表達顯著增強，說明缺血再灌注損傷產(chǎn)生的凋亡刺激信號激活了依賴于Caspase－3家族的細胞凋亡機制而誘導(dǎo)肝細胞凋亡，這與其他的相關(guān)報道基本一致［5］。

本實驗結(jié)果顯示:七味紅花殊勝散對肝損傷的保護作用可能主要與其保護抗氧化酶的活性，提高機體的抗氧化能力有關(guān);另外可引起細胞外Ca2+大量內(nèi)流，胞漿Ca2+是凋亡的第二信使，它激活蛋白激酶C等，從而激活凋亡相關(guān)基因，誘導(dǎo)細胞進入凋亡通道［6］。促進蛋白質(zhì)合成及解毒作用，減少了細胞損傷，并有促肝細胞再生、恢復(fù)肝功能的作用。

［1］袁林，楊建青，渚光平等.潘生丁對實驗大鼠肝缺血再灌注損傷的影響［J］.腹部外科，2006，19(4):244－246.

［2］王永剛，葉啟發(fā)，齊海智.潘生丁對大鼠移植肝缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究［J］.中華現(xiàn)代手術(shù)學雜志，2006，10(6):412－414.

［3］彭松林，顧璽，戴朝六，等.參附注射液對肝缺血再灌注大鼠血漿前列環(huán)素和血栓素A2及肝組織ATP酶的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學報，2007，5(4):427－431.

［4］王新良，王新穎，王佩薇等.一氧化氮在腎缺血再灌注損傷中的作用［J］.中國應(yīng)用生理學雜志，2006，22(11):2142－2145.

［5］Chao FC，David W，Chie PH，et a1.The protective effect of niacinamide on ischemia－reperfusion－induced liver injury［J］.Biomedical Sci，2004，8:446－452..

［6］韓英，劉楠，陳榮華，等.大鼠腦缺血再灌注損傷后的細胞凋亡與Bcl－2、Bax的表達［J］.中國臨床神經(jīng)科學，2006，14(1):15～19.