田曉燕，蒙美蓮，張笑宇，董瑞利，胡 俊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019）

馬鈴薯是世界第四大糧食作物，僅次于水稻、小麥和玉米[1]。中國(guó)是一個(gè)馬鈴薯生產(chǎn)大國(guó)，其總產(chǎn)量和面積均占世界第一位。馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，除含有大量淀粉、蛋白質(zhì)，還含有豐富的維生素A和C以及礦物質(zhì)[2]。近年來(lái)，隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，馬鈴薯種植面積逐漸擴(kuò)大，種薯調(diào)用頻繁，重迎茬問(wèn)題比較普遍，在馬鈴薯種植區(qū)黑痣病日趨加重，且發(fā)病較為普遍，一般可造成馬鈴薯減產(chǎn)15%左右，個(gè)別年份可達(dá)全田毀滅[3]。2009年調(diào)查了內(nèi)蒙古烏蘭察布市馬鈴薯種植區(qū)，嚴(yán)重的地塊馬鈴薯黑痣病發(fā)病率高達(dá)90%，該病嚴(yán)重影響著馬鈴薯的產(chǎn)量與品質(zhì)，阻礙了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

馬鈴薯黑痣病又稱“黑色粗皮病、莖潰瘍病”，是一種重要的土傳真菌性病害，其病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）[4]。國(guó)際上運(yùn)用菌絲融合技術(shù)將立枯絲核菌分成不同的群系/融合群（Anastomosis group簡(jiǎn)稱AG），許多植物病理學(xué)家又分別予以生理、生化、病理遺傳等方面的研究。為了研究馬鈴薯黑痣病菌菌絲融合群組成、分布和親和群的組成情況，本試驗(yàn)對(duì)采自不同地區(qū)的馬鈴薯黑痣病菌進(jìn)行了菌絲融合群鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離

從內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市和烏蘭察布市、山西省大同市、陜西省榆林市、黑龍江省等地的馬鈴薯上采集具有黑痣病典型癥狀的新鮮病害標(biāo)本，采用組織分離法，將病組織在PDA平板上于25℃下恒溫培養(yǎng)48 h后，挑取病組織周圍長(zhǎng)出的尖端菌絲，移入PDA平板純化培養(yǎng)。將認(rèn)為是立枯絲核菌的菌株通過(guò)鏡檢、形態(tài)學(xué)鑒定和致病性測(cè)定，確認(rèn)為病原菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源

由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)周而勛教授惠贈(zèng)的AG-1-ⅠA、AG-1-ⅠB、AG-2-1、AG-2-ⅢB、AG-3 共 5個(gè)菌株為標(biāo)準(zhǔn)菌株。

1.3 核相測(cè)定

參照張?zhí)鞎訹5]的方法，采用番紅染色。將活化后的菌株接入培養(yǎng)皿內(nèi)，在菌餅周圍培養(yǎng)基上斜插入4個(gè)蓋玻片。25℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲生長(zhǎng)至蓋玻片的1/2處時(shí)取出，經(jīng)番紅O-KOH染色1～2 min后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞核數(shù)目。每個(gè)菌株重復(fù)3皿。

1.4 菌絲融合群測(cè)定

參照陳延熙等[6]的玻片對(duì)峙法，將待測(cè)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株同時(shí)置于25℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h后，用打孔器在菌落邊緣切取直徑5 mm的菌餅。在無(wú)菌載玻片上涂一薄層水瓊脂（WA）培養(yǎng)基，挑取標(biāo)準(zhǔn)菌株菌餅置于玻片中央，同一待測(cè)菌株菌餅分放兩側(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株間隔1.2～1.5 cm。將載玻片放在注有少量無(wú)菌水的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，25℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h，當(dāng)兩菌落前緣生長(zhǎng)相遇并交疊 5 mm時(shí)，鏡檢二者菌絲融合情況。每菌株重復(fù)3次。

菌絲融合群的鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下：

A完全融合：接觸細(xì)胞間細(xì)胞壁溶解，原生質(zhì)融合，互有引誘現(xiàn)象；

B不完全融合：菌絲接觸，細(xì)胞壁溶解后細(xì)胞死亡；

C完全不融合：細(xì)胞壁不溶解，兩菌互不干擾對(duì)方，交叉而過(guò)。

1.5 營(yíng)養(yǎng)親和群的鑒定

將同一融合群的所有菌株，按3個(gè)一組，成正三角形排列接種于 PSA培養(yǎng)基上。25℃下對(duì)峙培養(yǎng)2～4 d，觀察其生長(zhǎng)情況，每組重復(fù)3次。根據(jù)兩菌株間菌絲交會(huì)處分離帶的有無(wú)判斷兩菌株是否親和，無(wú)分離帶的視為同一親和群，有分離帶的視為不同親和群。通過(guò)合理組合，使同一菌株與其他各菌株間均得到對(duì)峙比較，以此對(duì)所有菌株進(jìn)行親和群判別。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株分離鑒定結(jié)果

從各地區(qū)采集的馬鈴薯黑痣病標(biāo)樣中分離出44個(gè)分離物，經(jīng)鑒定和致病性測(cè)定，均為馬鈴薯黑痣病菌（表1）。

表1 馬鈴薯黑痣病菌菌株編號(hào)及其采集地點(diǎn)Table 1 R.solani strains isolated from potatoes in different areas

圖1 供試菌株（24號(hào)菌）多核形態(tài)圖Figure1 Morphologic characters of multinucleate R.solani strain（24th strain）

圖2 供試菌株不親和表現(xiàn)Figure2 Strains were not compatible

表2 各融合群內(nèi)不同營(yíng)養(yǎng)親和群出現(xiàn)頻率Table2 Frequencies of anastomosis groups(AGs)and their vegetative compatibility groups(VCGs)

2.2 核相測(cè)定結(jié)果

經(jīng)細(xì)胞核染色核相鑒定結(jié)果表明，所有供試菌株均為多核，幼期營(yíng)養(yǎng)菌絲細(xì)胞核數(shù)為3～18個(gè)（圖1）。

2.3 菌絲融合群測(cè)定結(jié)果

根據(jù)菌絲融合群的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，44個(gè)供試菌株分為3個(gè)類群：AG-1-ⅠB（1個(gè)，為完全融合）；AG-3（38個(gè)，除了39，40，41，42，43號(hào)為不完全融合外，其余均為完全融合），非融合類（5個(gè)，為完全不融合）。結(jié)果表明AG-3為馬鈴薯種植區(qū)的優(yōu)勢(shì)融合群，所占比例為測(cè)定菌株的86.36%。AG-1-ⅠB融合群所占比例較少，僅為2.27%（表2）。

2.4 營(yíng)養(yǎng)親和群鑒定結(jié)果

圖3 供試菌株親和表現(xiàn)Figure3 Strains were compatible

經(jīng)過(guò)供試菌株的合理組合、對(duì)峙培養(yǎng)（圖2、圖3），結(jié)果顯示：44個(gè)菌株可被劃分為19個(gè)不同的營(yíng)養(yǎng)親和群。表明了馬鈴薯黑痣病菌菌絲融合群下具有明顯的營(yíng)養(yǎng)親和群的分化，并且各親和群出現(xiàn)頻率差異很大。AG-3-5出現(xiàn)頻率最高（15.79%），AG-3-1、AG-3-2、AG-3-8出現(xiàn)頻率次之（13.16%），AG-3-10、AG-3-11、AG-3-12、AG-3-13、AG-3-14、AG-3-15和AG-3-16出現(xiàn)頻率最低（2.63%），可見(jiàn)不同馬鈴薯種植區(qū)黑痣病菌菌絲融合群的優(yōu)勢(shì)親和群為AG-3-5（表2）。

3 討 論

絲核菌是一類在自然界中廣泛存在的真菌，全世界各地的耕作土壤中均有分布，其中有許多種很容易從染病植株及土壤中分離得到。絲核菌的寄主范圍極廣，根據(jù)報(bào)道絲核菌可侵染43科200余種植物。迄今為止，立枯絲核菌的融合群己增至12個(gè)，而融合亞群至少已有18個(gè)[7]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)我國(guó)部分作物上的立枯絲核菌融合群進(jìn)行了較多的研究。彭學(xué)文等[8]報(bào)道，在墨西哥引起馬鈴薯莖基腐的立枯絲核菌的融合群為AG-3和AG-4。AG-3和AG-4各占73.5%、26.5%。

本試驗(yàn)根據(jù)現(xiàn)已得到的標(biāo)準(zhǔn)菌株初步研究了不同地區(qū)馬鈴薯黑痣病菌融合群的鑒定分類。從不同地區(qū)馬鈴薯種植區(qū)采集的病樣上分離獲得的立枯絲核菌44株，在地域、品種和耕作方法上均有一定的代表性，基本上能反映馬鈴薯黑痣病發(fā)生和分布特點(diǎn)等實(shí)際情況。本試驗(yàn)通過(guò)載玻片定位融合法判別與判定，初步確定了不同地區(qū)馬鈴薯黑痣病病原菌立枯絲核菌菌絲融合群有AG-3和AG-1-ⅠB兩個(gè)，不同菌絲融合群間在地域分布、出現(xiàn)頻率上均有一定差異。其中AG-3出現(xiàn)頻率最高，分布最廣，是馬鈴薯黑痣病的優(yōu)勢(shì)融合群。說(shuō)明馬鈴薯黑痣病菌在不同地區(qū)存在分化現(xiàn)象和優(yōu)勢(shì)融合群，這一結(jié)果與彭學(xué)文等[8]報(bào)道一致。據(jù)陳延熙等[6]的測(cè)定結(jié)果，AG-1-ⅠB菌株是分離自那些類似紋枯病癥狀的鵝觀草和狗尾草上的菌株，AG-3菌株是馬鈴薯莖基腐病原菌。但本試驗(yàn)37號(hào)菌是從馬鈴薯上分離得到，卻歸入AG-1-ⅠB融合群，這一點(diǎn)卻不同于前人的研究。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在供試的立枯絲核菌菌株中，來(lái)源于不同地域的馬鈴薯黑痣病菌菌株經(jīng)鑒定屬于同一菌絲融合群下的同一親和群，如28號(hào)菌與31號(hào)、32號(hào)等分別采自內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗和陜西省榆林市，測(cè)定同屬于AG-3-5融合群；而來(lái)源于同一地區(qū)的馬鈴薯黑痣病菌卻屬于不同的親和群，如43號(hào)和44號(hào)菌雖然同采于內(nèi)蒙古烏蘭察布市卓資縣，卻分屬于AG-3-8和AG-3-9兩個(gè)親和群。這表明了引起馬鈴薯黑痣病的立枯絲核菌類群的復(fù)雜性，可能與地區(qū)生態(tài)條件差異有一定關(guān)系并且在地域上具有一定的類群差異。由于融合群的標(biāo)準(zhǔn)菌株有限，以至于5個(gè)菌株未被鑒定出其所在的融合類群，有待于進(jìn)一步的深入研究。本試驗(yàn)從總體上反映了絲核菌分布的多樣性、豐富性以及融合群間關(guān)系的復(fù)雜性。

[1]白曉東,杜珍,范向斌,等.基質(zhì)對(duì)馬鈴薯瘡痂病抑制效果研究初報(bào)[J].中國(guó)馬鈴薯,2002,16(6):332-334.

[2]徐征.土壤生態(tài)調(diào)控馬鈴薯晚疫病發(fā)生的研究[D].重慶：西南大學(xué),2006.

[3]邱廣偉.馬鈴薯黑痣病的發(fā)生與防治[J].糧食作物,2009(6):133-134.

[4]李乾坤,孫順娣,李敏權(quán).馬鈴薯立枯絲核菌的研究[J].馬鈴薯雜志,1998,2(2):79-85.

[5]張?zhí)鞎?Rhizoctonia solani菌絲融合群的研究[J].湖南師范學(xué)院學(xué)報(bào),1984(2):69-7l.

[6]陳延熙,張敦華,段霞渝,等.關(guān)于Rhizoctonia solani菌絲融合分類和有性世代的研究[J].植物病理學(xué)報(bào),1985,15(3):139-143.

[7]Ogoshi A.Studies on the taxonomy of the genus Rhizoctonia[J].Ann Phytopath Soc Japan,1984,50:307-309.

[8]彭學(xué)文,朱杰華.河北省馬鈴薯真菌病害種類及分布[J].中國(guó)馬鈴薯,2008,22(1):31-33.